ГОСТ 11285-93: Железы поджелудочные крупного рогатого скота и свиней замороженные. Технические условия
Дата ведения 01.01.05
Настоящий стандарт распространяется на замороженные поджелудочные железы крупного рогатого скота н свиней, признанные ветеринарным контролем годными для производства инсулина.
Требования настоящего стандарта являются обязательными.
Поджелудочные железы должны быть собраны раздельно от каждого вида скота и обработаны по технологической инструкции с соблюдением санитарных правил для предприятий мясной промышленности и соответствовать требованиям настоящего стандарта.
1.1. Характеристики
1.1.1. В зависимости от вида скота поджелудочные железы подразделяют на:
поджелудочные железы крупного рогатого скота; поджелудочные железы евнней.
В зависимости от качества поджелудочные железы подразделяют на два сорта: первый и второй.
Не допускается смешение поджелудочных желез разных видов скота.
1.1.2. По органолептическим и физико-химическим показателям поджелудочные железы должны соответствовать требованиям, указанным в табл. 1.
Иэлдиис официальное
i. технические требования
1.2. Маркировка
1.2.1. В каждый ящик вкладывают ярлык с указанием: наименования предприятия-изготовителя, его подчиненности
н (или) его товарного знака;
наименования железы (с указанием вида скота) и ее сорта;
даты сбора железы;
массы нетто и брутто, кг;
срока и условий хранения;
номера упаковщика;
обозначения настоящего стандарта.
1.2.2. Транспортная маркировка — по ГОСТ 14192 с нанесением маинпуляииопного знака «Ограничение температуры*.
Маркировку, характеризующую продукцию, наносят на каждую единицу тары несмывающейся непахнущей краской при помощи штампа, трафарета или наклеивания ярлыка с указанием дополнительных данных:
наименования предприятия-изготовителя, его подчиненности и (или) его товарного знака;
наименования железы (с указанием вида скота) к ее сорта;
даты сбора железы;
массы нетто Я брутто, кг;срока н условий хранения; обозначения настоящего стандарта. 1.3. Упаковка
1.3.1. Замороженные поджелудочные железы одного вида скота н сорта упаковывают в дощатые ящики по ГОСТ 13361 или в ящики из гофрированного картона по ГОСТ 13513.
1.3.2. Ящики должны быть чистыми, сухими, выстланы внутри полиэтиленовой пленкой по ГОСТ 10354. Допускаются другие полимерные пленки, разрешенные к применению органами здравоохранения. В заполненных ящиках выступающие края пленки должны полностью закрывать сверху поджелудочные железы. Укладывание поджелудочных желез в ящики должно быть плотным, не допускающим их перемещения при встряхивании.
2. ПРИЕМКА
2.1. Поджелудочные железы принимают партиями. Под партиен понимают любое количество замороженных поджелудочных желез одного вида скота н сорта, предназначенное к одновременной сдаче-приемке и оформленное одним документом о качестве установленной формы.
2.2. Соответствие упаковки, маркировки требованиям настоящего стандарта и отсутствие следов лодмокания и подтеков проверяют на «каждой ящике.
2.3. Для проверки соответствия качества поджелудочных желез требованиям настоящего стандарта из разных мест партии отбирают выборку в объеме 5% упаковочных единиц, но не менее 5 ящиков.
2.4. При получении неудовлетворительных результатов испытаний хотя бы по одному показателю по нему проводят повторные испытания удвоенного количества выборок, взятых от той же партии. Результаты повторных испытаний распространяют на всю партию.
2.5. При повышенной массовой доле жира в поджелудочных железах второго сорта они могут быть приняты по согласованию с потребителем.
2.6. Массовую долю инсулина определяют по требованию потребителя.
3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ
3.1. Отбор и подготовка проб
Для проведения испытаний при замораживании поджелудочных желез поштучно берут не менее чем по 5 желез из каждого 2—566 ящика, а при замораживании поджелудочных желез в блоках и* разных слоен каждого ящика, отобранного в выборку, отбирают точечные пробы массой 180—200 г. Из точечных проб составляют объединенную пробу массой (1000±20) г, измельчают на мясорубке и тща!ельно перемешивают, не допуская подпития температуры в измельченной пробе выше 4°С.
3.2. О п редел ей ие внешнего вида и цвета Внешний вид и цвет замороженных поджелудочных желез определяют визуально при дневном свете.
Целостность желез и наличие на них прирезей жировой и соединительной тканей определяют после частичного оттаивания взятых на анализ желез путем визуального осмотра.
3.3. Определение температуры
3.3.1, Аппаратура
Термометр стеклянный жидкостной (не ртутный), вмонтиро-ыанный в металлическую оправу, с диапазоном измерения от минус 38 до 0*С с допускаемой погрешностью измерении ± 1°С.
3.3.2. Проведение испытания
В замороженной поштучно или и ниде блоков (пластин) поджелудочной железе делают отверстие и термометром измеряют температуру на глубине (2.0*0,5) см. Отверстие можно сделать коловоротом вручную. Сверло коловорота должно быть предварительно охлаждено до температуры не выше минус 18"С.
3.4. Определение массовой доли жнра с использованием экстракционного аппарата Сок-слета
3.4.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Шкаф сушильный, обеспечивающий заданный температурный режим )105±0>5)°С.
Эксикатор 2 -290 по ГОСТ 25336.
Аппарат Сокслета с экстракционной колбой вместимостью [50 см».
Стаканчики для взвешивания СВ-24/10 по ГОСТ 25336. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026. Песок очищенный. Вата обезжиренная.
Эфир пстролейный по ТУ 6—02—1244 с температурой кипение; 40—60*С или эфир этиловый по ТУ 7506804—97, х.ч.
3.4.2. Проведение испытания
5 г измельченной поджелудочной железы взвешивают с точностью до 0.01 г в предварительно доведенном до постоянной массы стаканчике с (5,5±0»5) г очищенного песка. Навеску железы тщательно перемешивают с песком и высушивают в сушильном шкафу при температуре (100±015)°С в течение 2 ч. Высушенную навеску количественно переносят в бумажную гильзу, на дно которой кладут кусочек обезжиренной ваты. Стаканчик после ле* реноса высушенной навески протирают ватой, смоченной эфиром, и помешают ее в гильзу. Гильзу тщательно закрывают, высушивают в сушильном шкафу, при температуре (105±0>5)°С до постоянной массы и помещают в экстрактор аппарата Со колет а. Экстракцию ведут 6 ч при 6—10 сливах экстракта в 1 ч. Полноту обезжиривания проверяют, нанося на фильтровальную бумагу каплю растворителя» стекаюшего из экстрактора. Процесс считают законченным при отсутствии жирною пятна на бумаге после испарения растворителя. По окончании экстракции гильзу высушивают сначала иод ТЯГОЙ, потом в сушильном шкафу при температуре (105±0,5)*С до постоянной массы.
3.4-3. Обработка результатов
3.4.3.1. Массовую долю жира (А') в процентах вычисляют ги» формуле
л ---,
л?»
где т— масса гильзы с навеской до экстрагирования, г; Ш| — масса гильзы с навеской после экстрагирования» г; г»2— масса навески поджелудочной железы, г.
3.4.3.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное ло первого десятичного знака.
3.4.3.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р=0,95 не должно превышать 14% по отношению к среднему арифметическому значению,
3.4.3.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, при Р=0,95 не должно превышать 18% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.5. Определение массовой доли жира с использованием жнромера
3.5.К Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначении 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г. Центрифуга ЦЛМП-24.
Термометр стеклянный жидкостной (не ртутный) < рачнва* жиромер 7—10 раз, затем пробкой вниз помешают на 40 ыин в предварительно нагретую по (78=2)"С водяную баню, после чего жиромеры переносят в центрифуг;., располагая их узким юнцом к центру, и центрифугируют при скорости 1500 об/мин • течение 10 мин. После чего жиромеры вновь помешают на 10 мин в водяную баню и затем снимают показатель жиромера.
При отсутствии четкой границы раздела между жиром и растворителем взбалтывание, нагревание и центрифугирование повторяют
3.5.3. Обработка результатов
35.3.1. Массовую долю жира (Л,) в процентах вычисляют но формуле
где п — высота столбика жира но шкале жиромера. деления; т — насев жира, соответствующая одному делению жиро-мера (0.011564 г — одно деление молочного жнромера; 0.052343 г — одно деление сливочного жнромера). г; т% — масса навески поджелудочной железы, г.
3.5.3.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное до первого десятичного знака.
3.5.3.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при /*=0.95 не должно превышать 15% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.5.3.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, не должно превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению при Р=0,95.
3.6. Оп р ед е л ен не массовой доли инсулина методом ионообменной хроматографии на колонках
3.6.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469 с отверстиями решетки диаметром от 3 до 4 мм.
Колориметр фотоэлектрический лабораторный по нормативно-технической документации с устройством для отечнтывания значения оптической плотности'и светофильтром с Хтд,= (600± 10) нм или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра. Потенциометр с погрешностью измерения не более ±0.05 рИ.
Термометр стеклянный жидкостной с диапазоном измерения от 0 до 100°С С допускаемой погрешностью измерения ±1°С. Мешалка.
Тарелки мелкие столовые диаметром 20 см. Кювета эмалированная для окрашивания хроматограмм. Пробирки П4—10—14/23 ХС по ГОСТ 25336. Воронка В-56—80 ГХС по ГОСТ 25336. Цилиндры 1—25. 1—50. 1 — 100 по ГОСТ 1770. Колонки стеклянные диаметром (30±5> мм. высотой {400± ±50) мм.
Пинетки 4-2—1; 4-2-2; 4-2-5; 8-2-0.1. Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Бумага хроматографическаи' быстрая (ленинградская или им-оортиэя) марки Б или С.
Вага медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. х.ч.. растворы I н 0.01 моль/дм1 и 200 г/дм'.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.. плотностью 1.19 г/см», растворы 1; 0.5 и 0.1 моль/дм', 180 г/дм1.
Кислота серная по ГОСТ 4204. х.ч.. плотностью 1.835 г/см1.
Кислота укелтнаи ледяная по ГОСТ 61, х. ч., растворы 20 и 800 г/дм1.
Медь (II) серно-кнелая 5-впдная по ГОСТ 4165. ч.д.а., раствор 125 г/дм*.
Индикатор бромфенолокый синий водорастворимый по ТУ
6—09—3719, ч.д.а,
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5902. растворы
650, 700 н 800 г/дм».
Инсулин кристаллический с активностью (25±1) Ед/мг. Аммонии уксуснокислый по ГОСТ 3117. ч.д.а.. раствор
0.2 моль/дм*. _
Аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х. ч., раствор 0.2 моль/дм1.
Аммиак по ГОСТ 3760. ч. ж. а., плютностмо 0.91 г/смА раствор
125 г/дм»,
Кислота трихлоруксуская кристаллическая по ТУ 6—09—1926.
ч.. раствор 100 г/дм».
Бутакол-1 по ГОСТ 6006. ч.л.а.. плотностью 0.8092 г/см».
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Катионит КУ 23 И по ТУ 6-05-211-971.
Допускается использование аппаратуры с техническими и метрологическими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.
36.2. Подготовка к испытанию
3.6.2.1. II риготовление системы растворитеяей Буганол-1. 800 г/дм», раствор уксусной кислоты и дистиллированную воду смешивают в соотношении 3:1:5.
3.6.2.2. Приготовление стандартного раствора инсулина
Навеску инсулина (9.6*0.1) мг с активностью (25± 1) Ед/миа растворяют в 6 см» раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм». Полученный раствор содержит 40 Ел инсулина в 1 си».
3.6.2.3. Приготовление красителя бромфенолевого синего Навеску 0,5 г индикатора бромфснолового синего водорастворимого растворяют в 40 си* дистиллированной поды, разводят в 920 ей* раствора уксусной .кислоты концентрации 20 г/дм4, затем добавляют 40 см1 раствора серко-кислой меди концентрации 125 г/дм1.
3.6.2.4. Приготовление 0,2 моао.Юм^ раствора аммония уксуснокислого рН (5.25±0,05)
Навеску 15,4 г аммония уксуснокислого растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до I дм", рН корректируют ледяной уксусной кислотой.
3.6.2.5. Приготовление 0,2 моль/дм* раствора аммония хлористого рН (9,5±0,2)
Навеску 10,7 г аммония хлористого растворяют в дистиллированной воде и доводит объем до 1 дм1. рТ1 раствора регулируют раствором соляной кислогы концентрации 180 г/дм3 или раствором аммиака концентрации ]25 г/дма.
3.6.2.6. Подготовка катионита К У 23 И Предварительно просеянный катноиит КУ 23 И диаметром зерен не менее 0,3 мм но влажном состоянии вносят в колонки, предварительно заполненные дистиллированной водой. Через слой катионита (на 60 г суховоздушной смолы) пропускают 2 дча раствора гидроокиси натрии концентрации I <моль/дмэ, 1 дм* д«-стнллированной воды, 2 дм1 раствора соляной кислоты концентрации 1 моль/дм8, 100 см3 раствора этилового спирта концентрации 700 г/дм*. Если катионит не был в употреблении, то описанную операцию повторяют дважды. Скорость пропускания растворов 10 см*/мнн.
3.6.3. Проведение испытания
К навеске измельченной поджелудочной железы массой 500 г добавляют 1,75 дм* раствора этилового спирта концентрации 800 г/дм1, подкисленного 2,25 см1 концентрированной серной кислоты, и перемешивают в течение 7 мин мешалкой при температуре (15±1)°С со скоростью (13±1) об/мин, затем приливают 16 см* раствора соляной кислоты концентрации 0.5 моль/дм3 и продолжают перемешивание в течение 2 ч. После чего отделяют экстракт от жмыха лрн помощи воронки через двойной слой марли, жмых заливают 0,75 дм1 раствора этилового спирта концентрации 650 г/дми н перемешивают в течение 40 мин. Отделяют экстракт от жмыха через двойной слой марли. Первый и второй экстракты объединяют, добавляют 200 г/дм* раствор гидроокиси натрия, устанавливая рН (4,5±0,1) {потенциомегричеекк).
Образовавшийся осадок через 5 мни отделяют фильтрацией через складчатый бумажный фильтр. Полученный фильтрат после установления в нем рН (3,5±0»1) (потенцнометрнческн) 180 г/дм* раствором соляной кислоты направляют на сорбцию.
Сорбиию инсулина осуществляют на предварительно подготов* ленном катноннте КУ 23 И, помешенном в количестве (60±5Ъ г в стеклянную колонку диаметром (30=5) мм и оысотой (*Сб± ±50) мм. путем подачи экстракта сверху со скоростью (!0± ±2) смЛ/мин, По окончании сорбции пропускают 700 г/дм1 раствор этилового спирта со скоростью (10^:2) см*/ынн ло полного удаления следов жира.
Окончание обезжиривания определяют в пробирке ло исчезновению мутного жирового кольца при наслаивании ]—2 см* исходящего из колонки спиртового раствора на 5—б сма воды.
Затем удаляют балластные белки путем пропускания 0,2 моль/дм^ раствора аммония уксунокислого с рН (5.25^0*05) со скоростью (10±2) смэ/мнн. Расход раствора аммония уксуснокислого составляет 3 дм3 на 60 г катноннта. Полноту удаления балластных веществ контролируют сиектрофотометрически при длине волны 280 им. Оптическая плотность не должна превышать 0.05.
Десорбцию инсулина осуществляют путем пропускания через* колонку 0,2 моль/дм* раствора аммония хлористого с рН {9,Ь± ±0.2) со скоростью (2±1) см3/мнн. Начало сбора элюата определяют по появлению помутнения при добавлении 0.3 см* элкь ата к 0*3 см3 раствора три хлору ксусной кислоты концентрации 100 г/дм3* Конец элюирования определяют по слабололожнтсль-ной реакции с 100 г/дм3 раствором трихлоруксусиой кислоты или спектрофотометрически до оптической плотности не меньше 0,05.
Объем элюата измеряют в кубических сантиметрах, определяв ют его активность методом круговой бумажной хроматографии.
Примечание* Перед нанесением на хроматограиму элюаг сенной поджелудочной железы разбавляют дистиллированной «одой, подкисленной 1 иодь/ды' раствором соляной кислоты до рН {2,5^: 0.1), в соотношении 1:1. Соответственно в формуле расчета массовой доли инсулина 0% умножают па 2*
По окружности бумаги для хроматографирования на расстоянии 2 см от центра круга пипеткой наносят по 0,02—0,03 сма элюата (в четыре точки) и стандартного раствора инсулина (в две точки). Диаметр хроматограммы 20 см. Хроматограммы по* мещают в мелкие тарелки диаметром около 20 см( куда предва* рительно наливают систему растворителей (50±5) см3. Бумажный круг соединяют с системой растворителей при ПОМОЩИ фитиля, сделанного из той же бумаги, и накрывают тарелкой.
Процесс хроматографирования осуществляют при температуре* 18 25Х н гечение 3 I По окончании процесса >;ромагюг[:;1ф1т;10- Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025.
Микроизмельчитель ткани РТ-1 по ТУ 64—1 — 1505.
Потенциометр с погрешностью измерения не более ±0,05 рН.
Центрифуга лабораторная типа К-23 или аналогичная.
Центрифуга с горизонтальным ротором н охлаждением.
Термостат лабораторный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима 30—50°С.
Гамма-счетчик колодезного типа (Гамма-1, Гамиа-2, Гамма-800 или аналогичный).
Пипетки полуавтоматические типа КПД по ТУ П52.706.003.
Наконечники для пипеток по ТУ П58.523.490.
Штатив лабораторный для пробирок.
Термометр стеклянный технический с диапазоном измерения О—№0°С с допускаемой погрешностью измерения ±.1°С. Встряхиватсль лабораторный.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Пробирки П4-5-14/23 ХС по ГОСТ 25336.
Стаканы В-1<—250. В-1—600 по ГОСТ 25336.
Колбы мерные Й-50— 2. 2—100—2, 2—200— 2. 2—1000—2 по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1—100, 1—1000 по ГОСТ 1770.
Ингибитор протеаз (соевый, яичный, «Горлокс» или аналогичный).
Сыворотка крови крупного или мелкого рогатого скота. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Кислота соляная по ГОСТ 3118. х. ч., плотностью 1,19 г/см3, раствор 0,01 моль/дм3.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. х. ч.
Аммоний серно-кнелый безводный по ГОСТ 3769, х. ч.
Натрий фосфорно-кислый одноззмещенный по ГОСТ 245, ч.д.з.. раствор 0,2 моль/лм3.
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный по ГОСТ 4172, ч.д.а.. раствор 0,2 моль/дм5.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.
Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552. х.ч., плотностью 1.72 г/см».
, Набор реактивов «РИА—ИНС— ПГ—125]» производства Института биоорганической химии АН БССР. 3.7.2. Подготовка к испытанию
3.7.2.1. Приготовление насыщенного раствора аммония серн о-к и с лого
516,5 г аммония еерно-кислого помешают в колбу вместимостью 1 лма, приливают в нее 500 см3 горячей дистиллирован- ноГ( воды. После полного растворения соли приготовленный раствор охлаждают до комнатной температуры. Срок хранения раствора 1 мес.
3.7.22. Приготовление иммуноглобулинов, свободных от инсулина
К 58 см5 сыворотки крови прибавляют 42 см1 насыщенного раствора аммония сернокислого и тщательно перемешивают, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. 11адосадочкую жидкость сливают, осадок растворяют в дистиллированной воде в объеме, равном исходному объему сыворотки крови. Таким •образом проводят трехкратное переосаждение иммуноглобулинов при вышеуказанных условиях.
Перед последним осаждением в пробирки вместимостью 5 см1 разливают по 2 см3 раствора иммуноглобулинов, а затем в каждую пробирку добавляют по 1.5 см3 насыщенного раствора аммонии сернокислого. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, центрифугируют при 3000 об/мни в течение 20 мин. Над-осадочную жидкость сливают, пробирки оставляют в наклонном положении на фильтровальной бумаге для удаления остатков раствора, после чего пробирки закрывают пробками.
Полученные таким образом иммуноглобулины хранят в морозильной камере бытового холодильника в течение 2 мес. Перед употреблением осадок размораживают и растворяют в 2 си3 дистиллированной воды.
3.7.2.3. При г отселение фосфатного буфера с рП (7,5±0./)
В мерную колбу вместимостью 200 сма вносят 81,0 см1 раствора натрия фосфорно-кислого двузамещенного концентрации 0,2 моль/дм3 н 19.0 см3 раствора натрия фосфорнокислого одно-"ла мешенного концентрации 0,2 моль/дм3. Содержимое колбы перемешивают н измеряют рН. Убедившись, что рН равно (7,5± ±0,1), объем раствора в колбе доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при температуре 4°С.
3.7.2.4. Приготовление фосфатного буфера с рН 7,4. содержащего ингибитор протеаз в количестве 300 ингиби рующих единиц в I см*
Приготовление раствора зависит от используемого для проведения аналаза ингибитора протеаз. При использовании ингибитора протеаз «Гордокс», содержащего 10000 ннгнбирующнх единиц в I см3. 1.5 см3 содержимого ампулы переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, н доводят объем колбы фосфатным буфером до 50 см3. Раствор должен быть свежеприготовленным к охлажденным до температуры 4°С. 3.7.2.5. Приготовление подкисленной воды дли разведения проб
В стакан вместимостью 500 см3 наливают 250 см3 дистиллированной воды и при постоянном перемешивании малыми порциями приливают 0,01 моль/дм3 раствор соляной кислоты ло достижения и воде рН 4,0 (потенниометрически). Приготовленною таким образом воду хранят в холодильнике при температуре 4еС.
3.7.2.6. П риготовление 0/)5 моль/дм3 раствора фосфатного буфера, содержащего 150 ингибирую-щих единиц в 1 см3
В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 25 см3 фосфатного буфера, содержащего 300 ингибируюшнх единиц в 1 см3, и объем раствора в колбе доводят подкисленной до рН 4,0 водой до метки. Раствор готовят перед употреблением.
3.7.2.7. Приготовление первого зкетрагирующе-го раствора
167 см5 дистиллированной воды амешивают с 833 сма этилового спирта, а затем к раствору прибавляют 13,6 см3 концентрированной ортофосфорной кислоты. Раствор готовят перед употреблением и охлаждают до температуры 4ЛС.
3.7.2.8. Приготовление второго экстрагирующего раствора
375 см3 дистиллированной воды смешивают с 625 см3 96-градусного этилового спирта, затем к раствору прибавляют 2,7 см3 концентрированной ортофосфорной кислоты.
3.7.2.9. Приготовление растворов калибровочных проб, антисыворотки, 125,-и н с у Л и н а и буферного раствора
Растворы калибровочных проб, антнсывопоткн и 125|'ннсулнна готовят из набора реактивов «РИА-ИНС-ПТ—125;» в соответствии с инструкцией но применению, утвержденной в установленном порядке. Буферный раствор и раствор полиэтилен гликоля в данном наборе реактивов поставляют готовым к употреблению.
3.7.2.10. Подготовка сырья к испытанию Навеску |00 г измельченной поджелудочной железы гомогенизируют в 4-кратном объеме первого экстрагирующего раствора на микроизмельчителе тканей РТ-1 в течение 5 мин при 8000 об.'мнн, а затем в течение 10 мин при 6000 об/мин. По окончании гомогенизации на РТ-1 измеряют объем полученного гомогената | V» >.
10 см3 гомогената помещают в стакан стеклянного гомогенизатора и продолжают дальнейшее измельчение ткани в течение 10 мин, а затем переносят его в центрифужный стакан или пробирку и центрифугируют в течение (25±5) мин в центрифуге с охлаждением при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в мерный цилиндр и измеряют ее объем. К осадку приливают второй экстрагирующий раствор в объеме, равном объему над-осадочной жидкости, и стеклянной палочкой хорошо перемешивают осадок с раствором. После перемешивания содержимое стакана или центрифужной пробирки переносят в стакан стеклянного гомогенизатора и проводят гомогенизацию осадка в течение 10 мин. не допуская поднятия температуры при гомогенизации в растворе выше 4СС. Гомогенат переносят в центрифужный стакан или пробирку и проводят центрифугирование в течение (25± ±5) мин в центрифуге с охлаждением при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость присоединяют к первому экстракту, перемешивают содержимое цилиндра стеклянной палочкой и измеряют общий объем объединенных экстрактов {V?).
0.1 см1 объединенного экстракта последовательно разводят охлажденной до 4°С подкисленной до рИ 4,0 водой в НО', 10*. 10* и 10* раз.
Из полученных разведений 10» и 10* отбирают по 0,25 см3 раствора и смешивают с равным количеством фосфатного буфера, содержащего 300 Ед/смэ нпгибитора протеаз.
3.7.3. Проведение испытания
В пробирки при комнатной температуре вносят растворы реагентов в последовательности и количестве, указанных в табл. 2.
Таблица 2
си'
Рихсиш й пор в дм я> ян ее оная . впиши, л пробит»:
т н К п
Буферные раствор 0.4 0.2 0,1 0.1
1251 -инсулин 0.1 0,1 а! 0.1
Калибровочные пробы Ка0,1 0,1
Определяемые пробы — _ 0.1
Антисыворотка _ _. 0.1 0,1
Иммуноглобулины — — 0.1
0,05 иоль/дн1 фосфатный
буфер — 0,1 0,1 —
Примечание. Т — общая активность 125*-инсулин», добавляемого в одну пробирку; Н — н«специфическое связывание для калибровки; К — калибровочные пробы;
П — определяемые пробы. ^ 3.7.4.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное до первого десятичного знака.
3.7.4.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р = 0,95 не должно превышать 17% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.7.4.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, при Р=0,У5 не должно превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению.
4. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ
4.1. Транспортирование
Замороженные поджелудочные железы транспортируют всеми видами транспорта при температуре не выше Минус 2СгС в соответствии с правилами перевозок скоропортящихся грузов, действующими.на соответствующем виде транспорта. Транспортирование замороженных поджелудочных желез в пакетированном виде — по ГОСТ 24597. ГОСТ 21650. ГОСТ 26663. 4.2. Хранение
Замороженные поджелудочные железы .хранят в упакованном виде и камере при температуре не выше минус 204"..
Срок хранения замороженных поджелудочных желез — 6 мес с момента сбора.
Хранение замороженных поджелудочных желез на складах транспортных организаций не допускается.
Настоящий стандарт распространяется на замороженные поджелудочные железы крупного рогатого скота н свиней, признанные ветеринарным контролем годными для производства инсулина.
Требования настоящего стандарта являются обязательными.
Поджелудочные железы должны быть собраны раздельно от каждого вида скота и обработаны по технологической инструкции с соблюдением санитарных правил для предприятий мясной промышленности и соответствовать требованиям настоящего стандарта.
1.1. Характеристики
1.1.1. В зависимости от вида скота поджелудочные железы подразделяют на:
поджелудочные железы крупного рогатого скота; поджелудочные железы евнней.
В зависимости от качества поджелудочные железы подразделяют на два сорта: первый и второй.
Не допускается смешение поджелудочных желез разных видов скота.
1.1.2. По органолептическим и физико-химическим показателям поджелудочные железы должны соответствовать требованиям, указанным в табл. 1.
Иэлдиис официальное
i. технические требования
1.2. Маркировка
1.2.1. В каждый ящик вкладывают ярлык с указанием: наименования предприятия-изготовителя, его подчиненности
н (или) его товарного знака;
наименования железы (с указанием вида скота) и ее сорта;
даты сбора железы;
массы нетто и брутто, кг;
срока и условий хранения;
номера упаковщика;
обозначения настоящего стандарта.
1.2.2. Транспортная маркировка — по ГОСТ 14192 с нанесением маинпуляииопного знака «Ограничение температуры*.
Маркировку, характеризующую продукцию, наносят на каждую единицу тары несмывающейся непахнущей краской при помощи штампа, трафарета или наклеивания ярлыка с указанием дополнительных данных:
наименования предприятия-изготовителя, его подчиненности и (или) его товарного знака;
наименования железы (с указанием вида скота) к ее сорта;
даты сбора железы;
массы нетто Я брутто, кг;срока н условий хранения; обозначения настоящего стандарта. 1.3. Упаковка
1.3.1. Замороженные поджелудочные железы одного вида скота н сорта упаковывают в дощатые ящики по ГОСТ 13361 или в ящики из гофрированного картона по ГОСТ 13513.
1.3.2. Ящики должны быть чистыми, сухими, выстланы внутри полиэтиленовой пленкой по ГОСТ 10354. Допускаются другие полимерные пленки, разрешенные к применению органами здравоохранения. В заполненных ящиках выступающие края пленки должны полностью закрывать сверху поджелудочные железы. Укладывание поджелудочных желез в ящики должно быть плотным, не допускающим их перемещения при встряхивании.
2. ПРИЕМКА
2.1. Поджелудочные железы принимают партиями. Под партиен понимают любое количество замороженных поджелудочных желез одного вида скота н сорта, предназначенное к одновременной сдаче-приемке и оформленное одним документом о качестве установленной формы.
2.2. Соответствие упаковки, маркировки требованиям настоящего стандарта и отсутствие следов лодмокания и подтеков проверяют на «каждой ящике.
2.3. Для проверки соответствия качества поджелудочных желез требованиям настоящего стандарта из разных мест партии отбирают выборку в объеме 5% упаковочных единиц, но не менее 5 ящиков.
2.4. При получении неудовлетворительных результатов испытаний хотя бы по одному показателю по нему проводят повторные испытания удвоенного количества выборок, взятых от той же партии. Результаты повторных испытаний распространяют на всю партию.
2.5. При повышенной массовой доле жира в поджелудочных железах второго сорта они могут быть приняты по согласованию с потребителем.
2.6. Массовую долю инсулина определяют по требованию потребителя.
3. МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЙ
3.1. Отбор и подготовка проб
Для проведения испытаний при замораживании поджелудочных желез поштучно берут не менее чем по 5 желез из каждого 2—566 ящика, а при замораживании поджелудочных желез в блоках и* разных слоен каждого ящика, отобранного в выборку, отбирают точечные пробы массой 180—200 г. Из точечных проб составляют объединенную пробу массой (1000±20) г, измельчают на мясорубке и тща!ельно перемешивают, не допуская подпития температуры в измельченной пробе выше 4°С.
3.2. О п редел ей ие внешнего вида и цвета Внешний вид и цвет замороженных поджелудочных желез определяют визуально при дневном свете.
Целостность желез и наличие на них прирезей жировой и соединительной тканей определяют после частичного оттаивания взятых на анализ желез путем визуального осмотра.
3.3. Определение температуры
3.3.1, Аппаратура
Термометр стеклянный жидкостной (не ртутный), вмонтиро-ыанный в металлическую оправу, с диапазоном измерения от минус 38 до 0*С с допускаемой погрешностью измерении ± 1°С.
3.3.2. Проведение испытания
В замороженной поштучно или и ниде блоков (пластин) поджелудочной железе делают отверстие и термометром измеряют температуру на глубине (2.0*0,5) см. Отверстие можно сделать коловоротом вручную. Сверло коловорота должно быть предварительно охлаждено до температуры не выше минус 18"С.
3.4. Определение массовой доли жнра с использованием экстракционного аппарата Сок-слета
3.4.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Шкаф сушильный, обеспечивающий заданный температурный режим )105±0>5)°С.
Эксикатор 2 -290 по ГОСТ 25336.
Аппарат Сокслета с экстракционной колбой вместимостью [50 см».
Стаканчики для взвешивания СВ-24/10 по ГОСТ 25336. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026. Песок очищенный. Вата обезжиренная.
Эфир пстролейный по ТУ 6—02—1244 с температурой кипение; 40—60*С или эфир этиловый по ТУ 7506804—97, х.ч.
3.4.2. Проведение испытания
5 г измельченной поджелудочной железы взвешивают с точностью до 0.01 г в предварительно доведенном до постоянной массы стаканчике с (5,5±0»5) г очищенного песка. Навеску железы тщательно перемешивают с песком и высушивают в сушильном шкафу при температуре (100±015)°С в течение 2 ч. Высушенную навеску количественно переносят в бумажную гильзу, на дно которой кладут кусочек обезжиренной ваты. Стаканчик после ле* реноса высушенной навески протирают ватой, смоченной эфиром, и помешают ее в гильзу. Гильзу тщательно закрывают, высушивают в сушильном шкафу, при температуре (105±0>5)°С до постоянной массы и помещают в экстрактор аппарата Со колет а. Экстракцию ведут 6 ч при 6—10 сливах экстракта в 1 ч. Полноту обезжиривания проверяют, нанося на фильтровальную бумагу каплю растворителя» стекаюшего из экстрактора. Процесс считают законченным при отсутствии жирною пятна на бумаге после испарения растворителя. По окончании экстракции гильзу высушивают сначала иод ТЯГОЙ, потом в сушильном шкафу при температуре (105±0,5)*С до постоянной массы.
3.4-3. Обработка результатов
3.4.3.1. Массовую долю жира (А') в процентах вычисляют ги» формуле
л ---,
л?»
где т— масса гильзы с навеской до экстрагирования, г; Ш| — масса гильзы с навеской после экстрагирования» г; г»2— масса навески поджелудочной железы, г.
3.4.3.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное ло первого десятичного знака.
3.4.3.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р=0,95 не должно превышать 14% по отношению к среднему арифметическому значению,
3.4.3.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, при Р=0,95 не должно превышать 18% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.5. Определение массовой доли жира с использованием жнромера
3.5.К Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначении 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г. Центрифуга ЦЛМП-24.
Термометр стеклянный жидкостной (не ртутный) < рачнва* жиромер 7—10 раз, затем пробкой вниз помешают на 40 ыин в предварительно нагретую по (78=2)"С водяную баню, после чего жиромеры переносят в центрифуг;., располагая их узким юнцом к центру, и центрифугируют при скорости 1500 об/мин • течение 10 мин. После чего жиромеры вновь помешают на 10 мин в водяную баню и затем снимают показатель жиромера.
При отсутствии четкой границы раздела между жиром и растворителем взбалтывание, нагревание и центрифугирование повторяют
3.5.3. Обработка результатов
35.3.1. Массовую долю жира (Л,) в процентах вычисляют но формуле
где п — высота столбика жира но шкале жиромера. деления; т — насев жира, соответствующая одному делению жиро-мера (0.011564 г — одно деление молочного жнромера; 0.052343 г — одно деление сливочного жнромера). г; т% — масса навески поджелудочной железы, г.
3.5.3.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное до первого десятичного знака.
3.5.3.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при /*=0.95 не должно превышать 15% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.5.3.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, не должно превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению при Р=0,95.
3.6. Оп р ед е л ен не массовой доли инсулина методом ионообменной хроматографии на колонках
3.6.1. Аппаратура, материалы, реактивы
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 3-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 500 г.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469 с отверстиями решетки диаметром от 3 до 4 мм.
Колориметр фотоэлектрический лабораторный по нормативно-технической документации с устройством для отечнтывания значения оптической плотности'и светофильтром с Хтд,= (600± 10) нм или спектрофотометр для измерения в видимой области спектра. Потенциометр с погрешностью измерения не более ±0.05 рИ.
Термометр стеклянный жидкостной с диапазоном измерения от 0 до 100°С С допускаемой погрешностью измерения ±1°С. Мешалка.
Тарелки мелкие столовые диаметром 20 см. Кювета эмалированная для окрашивания хроматограмм. Пробирки П4—10—14/23 ХС по ГОСТ 25336. Воронка В-56—80 ГХС по ГОСТ 25336. Цилиндры 1—25. 1—50. 1 — 100 по ГОСТ 1770. Колонки стеклянные диаметром (30±5> мм. высотой {400± ±50) мм.
Пинетки 4-2—1; 4-2-2; 4-2-5; 8-2-0.1. Марля медицинская по ГОСТ 9412.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Бумага хроматографическаи' быстрая (ленинградская или им-оортиэя) марки Б или С.
Вага медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. х.ч.. растворы I н 0.01 моль/дм1 и 200 г/дм'.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.. плотностью 1.19 г/см», растворы 1; 0.5 и 0.1 моль/дм', 180 г/дм1.
Кислота серная по ГОСТ 4204. х.ч.. плотностью 1.835 г/см1.
Кислота укелтнаи ледяная по ГОСТ 61, х. ч., растворы 20 и 800 г/дм1.
Медь (II) серно-кнелая 5-впдная по ГОСТ 4165. ч.д.а., раствор 125 г/дм*.
Индикатор бромфенолокый синий водорастворимый по ТУ
6—09—3719, ч.д.а,
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5902. растворы
650, 700 н 800 г/дм».
Инсулин кристаллический с активностью (25±1) Ед/мг. Аммонии уксуснокислый по ГОСТ 3117. ч.д.а.. раствор
0.2 моль/дм*. _
Аммоний хлористый по ГОСТ 3773, х. ч., раствор 0.2 моль/дм1.
Аммиак по ГОСТ 3760. ч. ж. а., плютностмо 0.91 г/смА раствор
125 г/дм»,
Кислота трихлоруксуская кристаллическая по ТУ 6—09—1926.
ч.. раствор 100 г/дм».
Бутакол-1 по ГОСТ 6006. ч.л.а.. плотностью 0.8092 г/см».
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Катионит КУ 23 И по ТУ 6-05-211-971.
Допускается использование аппаратуры с техническими и метрологическими характеристиками не хуже, а также реактивы по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.
36.2. Подготовка к испытанию
3.6.2.1. II риготовление системы растворитеяей Буганол-1. 800 г/дм», раствор уксусной кислоты и дистиллированную воду смешивают в соотношении 3:1:5.
3.6.2.2. Приготовление стандартного раствора инсулина
Навеску инсулина (9.6*0.1) мг с активностью (25± 1) Ед/миа растворяют в 6 см» раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм». Полученный раствор содержит 40 Ел инсулина в 1 си».
3.6.2.3. Приготовление красителя бромфенолевого синего Навеску 0,5 г индикатора бромфснолового синего водорастворимого растворяют в 40 си* дистиллированной поды, разводят в 920 ей* раствора уксусной .кислоты концентрации 20 г/дм4, затем добавляют 40 см1 раствора серко-кислой меди концентрации 125 г/дм1.
3.6.2.4. Приготовление 0,2 моао.Юм^ раствора аммония уксуснокислого рН (5.25±0,05)
Навеску 15,4 г аммония уксуснокислого растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до I дм", рН корректируют ледяной уксусной кислотой.
3.6.2.5. Приготовление 0,2 моль/дм* раствора аммония хлористого рН (9,5±0,2)
Навеску 10,7 г аммония хлористого растворяют в дистиллированной воде и доводит объем до 1 дм1. рТ1 раствора регулируют раствором соляной кислогы концентрации 180 г/дм3 или раствором аммиака концентрации ]25 г/дма.
3.6.2.6. Подготовка катионита К У 23 И Предварительно просеянный катноиит КУ 23 И диаметром зерен не менее 0,3 мм но влажном состоянии вносят в колонки, предварительно заполненные дистиллированной водой. Через слой катионита (на 60 г суховоздушной смолы) пропускают 2 дча раствора гидроокиси натрии концентрации I <моль/дмэ, 1 дм* д«-стнллированной воды, 2 дм1 раствора соляной кислоты концентрации 1 моль/дм8, 100 см3 раствора этилового спирта концентрации 700 г/дм*. Если катионит не был в употреблении, то описанную операцию повторяют дважды. Скорость пропускания растворов 10 см*/мнн.
3.6.3. Проведение испытания
К навеске измельченной поджелудочной железы массой 500 г добавляют 1,75 дм* раствора этилового спирта концентрации 800 г/дм1, подкисленного 2,25 см1 концентрированной серной кислоты, и перемешивают в течение 7 мин мешалкой при температуре (15±1)°С со скоростью (13±1) об/мин, затем приливают 16 см* раствора соляной кислоты концентрации 0.5 моль/дм3 и продолжают перемешивание в течение 2 ч. После чего отделяют экстракт от жмыха лрн помощи воронки через двойной слой марли, жмых заливают 0,75 дм1 раствора этилового спирта концентрации 650 г/дми н перемешивают в течение 40 мин. Отделяют экстракт от жмыха через двойной слой марли. Первый и второй экстракты объединяют, добавляют 200 г/дм* раствор гидроокиси натрия, устанавливая рН (4,5±0,1) {потенциомегричеекк).
Образовавшийся осадок через 5 мни отделяют фильтрацией через складчатый бумажный фильтр. Полученный фильтрат после установления в нем рН (3,5±0»1) (потенцнометрнческн) 180 г/дм* раствором соляной кислоты направляют на сорбцию.
Сорбиию инсулина осуществляют на предварительно подготов* ленном катноннте КУ 23 И, помешенном в количестве (60±5Ъ г в стеклянную колонку диаметром (30=5) мм и оысотой (*Сб± ±50) мм. путем подачи экстракта сверху со скоростью (!0± ±2) смЛ/мин, По окончании сорбции пропускают 700 г/дм1 раствор этилового спирта со скоростью (10^:2) см*/ынн ло полного удаления следов жира.
Окончание обезжиривания определяют в пробирке ло исчезновению мутного жирового кольца при наслаивании ]—2 см* исходящего из колонки спиртового раствора на 5—б сма воды.
Затем удаляют балластные белки путем пропускания 0,2 моль/дм^ раствора аммония уксунокислого с рН (5.25^0*05) со скоростью (10±2) смэ/мнн. Расход раствора аммония уксуснокислого составляет 3 дм3 на 60 г катноннта. Полноту удаления балластных веществ контролируют сиектрофотометрически при длине волны 280 им. Оптическая плотность не должна превышать 0.05.
Десорбцию инсулина осуществляют путем пропускания через* колонку 0,2 моль/дм* раствора аммония хлористого с рН {9,Ь± ±0.2) со скоростью (2±1) см3/мнн. Начало сбора элюата определяют по появлению помутнения при добавлении 0.3 см* элкь ата к 0*3 см3 раствора три хлору ксусной кислоты концентрации 100 г/дм3* Конец элюирования определяют по слабололожнтсль-ной реакции с 100 г/дм3 раствором трихлоруксусиой кислоты или спектрофотометрически до оптической плотности не меньше 0,05.
Объем элюата измеряют в кубических сантиметрах, определяв ют его активность методом круговой бумажной хроматографии.
Примечание* Перед нанесением на хроматограиму элюаг сенной поджелудочной железы разбавляют дистиллированной «одой, подкисленной 1 иодь/ды' раствором соляной кислоты до рН {2,5^: 0.1), в соотношении 1:1. Соответственно в формуле расчета массовой доли инсулина 0% умножают па 2*
По окружности бумаги для хроматографирования на расстоянии 2 см от центра круга пипеткой наносят по 0,02—0,03 сма элюата (в четыре точки) и стандартного раствора инсулина (в две точки). Диаметр хроматограммы 20 см. Хроматограммы по* мещают в мелкие тарелки диаметром около 20 см( куда предва* рительно наливают систему растворителей (50±5) см3. Бумажный круг соединяют с системой растворителей при ПОМОЩИ фитиля, сделанного из той же бумаги, и накрывают тарелкой.
Процесс хроматографирования осуществляют при температуре* 18 25Х н гечение 3 I По окончании процесса >;ромагюг[:;1ф1т;10- Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025.
Микроизмельчитель ткани РТ-1 по ТУ 64—1 — 1505.
Потенциометр с погрешностью измерения не более ±0,05 рН.
Центрифуга лабораторная типа К-23 или аналогичная.
Центрифуга с горизонтальным ротором н охлаждением.
Термостат лабораторный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима 30—50°С.
Гамма-счетчик колодезного типа (Гамма-1, Гамиа-2, Гамма-800 или аналогичный).
Пипетки полуавтоматические типа КПД по ТУ П52.706.003.
Наконечники для пипеток по ТУ П58.523.490.
Штатив лабораторный для пробирок.
Термометр стеклянный технический с диапазоном измерения О—№0°С с допускаемой погрешностью измерения ±.1°С. Встряхиватсль лабораторный.
Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
Пробирки П4-5-14/23 ХС по ГОСТ 25336.
Стаканы В-1<—250. В-1—600 по ГОСТ 25336.
Колбы мерные Й-50— 2. 2—100—2, 2—200— 2. 2—1000—2 по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1—100, 1—1000 по ГОСТ 1770.
Ингибитор протеаз (соевый, яичный, «Горлокс» или аналогичный).
Сыворотка крови крупного или мелкого рогатого скота. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Кислота соляная по ГОСТ 3118. х. ч., плотностью 1,19 г/см3, раствор 0,01 моль/дм3.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. х. ч.
Аммоний серно-кнелый безводный по ГОСТ 3769, х. ч.
Натрий фосфорно-кислый одноззмещенный по ГОСТ 245, ч.д.з.. раствор 0,2 моль/лм3.
Натрий фосфорно-кислый двузамещенный по ГОСТ 4172, ч.д.а.. раствор 0,2 моль/дм5.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962.
Кислота ортофосфорная по ГОСТ 6552. х.ч., плотностью 1.72 г/см».
, Набор реактивов «РИА—ИНС— ПГ—125]» производства Института биоорганической химии АН БССР. 3.7.2. Подготовка к испытанию
3.7.2.1. Приготовление насыщенного раствора аммония серн о-к и с лого
516,5 г аммония еерно-кислого помешают в колбу вместимостью 1 лма, приливают в нее 500 см3 горячей дистиллирован- ноГ( воды. После полного растворения соли приготовленный раствор охлаждают до комнатной температуры. Срок хранения раствора 1 мес.
3.7.22. Приготовление иммуноглобулинов, свободных от инсулина
К 58 см5 сыворотки крови прибавляют 42 см1 насыщенного раствора аммония сернокислого и тщательно перемешивают, затем центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20 мин. 11адосадочкую жидкость сливают, осадок растворяют в дистиллированной воде в объеме, равном исходному объему сыворотки крови. Таким •образом проводят трехкратное переосаждение иммуноглобулинов при вышеуказанных условиях.
Перед последним осаждением в пробирки вместимостью 5 см1 разливают по 2 см3 раствора иммуноглобулинов, а затем в каждую пробирку добавляют по 1.5 см3 насыщенного раствора аммонии сернокислого. Содержимое пробирок тщательно перемешивают, центрифугируют при 3000 об/мни в течение 20 мин. Над-осадочную жидкость сливают, пробирки оставляют в наклонном положении на фильтровальной бумаге для удаления остатков раствора, после чего пробирки закрывают пробками.
Полученные таким образом иммуноглобулины хранят в морозильной камере бытового холодильника в течение 2 мес. Перед употреблением осадок размораживают и растворяют в 2 си3 дистиллированной воды.
3.7.2.3. При г отселение фосфатного буфера с рП (7,5±0./)
В мерную колбу вместимостью 200 сма вносят 81,0 см1 раствора натрия фосфорно-кислого двузамещенного концентрации 0,2 моль/дм3 н 19.0 см3 раствора натрия фосфорнокислого одно-"ла мешенного концентрации 0,2 моль/дм3. Содержимое колбы перемешивают н измеряют рН. Убедившись, что рН равно (7,5± ±0,1), объем раствора в колбе доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при температуре 4°С.
3.7.2.4. Приготовление фосфатного буфера с рН 7,4. содержащего ингибитор протеаз в количестве 300 ингиби рующих единиц в I см*
Приготовление раствора зависит от используемого для проведения аналаза ингибитора протеаз. При использовании ингибитора протеаз «Гордокс», содержащего 10000 ннгнбирующнх единиц в I см3. 1.5 см3 содержимого ампулы переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3, н доводят объем колбы фосфатным буфером до 50 см3. Раствор должен быть свежеприготовленным к охлажденным до температуры 4°С. 3.7.2.5. Приготовление подкисленной воды дли разведения проб
В стакан вместимостью 500 см3 наливают 250 см3 дистиллированной воды и при постоянном перемешивании малыми порциями приливают 0,01 моль/дм3 раствор соляной кислоты ло достижения и воде рН 4,0 (потенниометрически). Приготовленною таким образом воду хранят в холодильнике при температуре 4еС.
3.7.2.6. П риготовление 0/)5 моль/дм3 раствора фосфатного буфера, содержащего 150 ингибирую-щих единиц в 1 см3
В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 25 см3 фосфатного буфера, содержащего 300 ингибируюшнх единиц в 1 см3, и объем раствора в колбе доводят подкисленной до рН 4,0 водой до метки. Раствор готовят перед употреблением.
3.7.2.7. Приготовление первого зкетрагирующе-го раствора
167 см5 дистиллированной воды амешивают с 833 сма этилового спирта, а затем к раствору прибавляют 13,6 см3 концентрированной ортофосфорной кислоты. Раствор готовят перед употреблением и охлаждают до температуры 4ЛС.
3.7.2.8. Приготовление второго экстрагирующего раствора
375 см3 дистиллированной воды смешивают с 625 см3 96-градусного этилового спирта, затем к раствору прибавляют 2,7 см3 концентрированной ортофосфорной кислоты.
3.7.2.9. Приготовление растворов калибровочных проб, антисыворотки, 125,-и н с у Л и н а и буферного раствора
Растворы калибровочных проб, антнсывопоткн и 125|'ннсулнна готовят из набора реактивов «РИА-ИНС-ПТ—125;» в соответствии с инструкцией но применению, утвержденной в установленном порядке. Буферный раствор и раствор полиэтилен гликоля в данном наборе реактивов поставляют готовым к употреблению.
3.7.2.10. Подготовка сырья к испытанию Навеску |00 г измельченной поджелудочной железы гомогенизируют в 4-кратном объеме первого экстрагирующего раствора на микроизмельчителе тканей РТ-1 в течение 5 мин при 8000 об.'мнн, а затем в течение 10 мин при 6000 об/мин. По окончании гомогенизации на РТ-1 измеряют объем полученного гомогената | V» >.
10 см3 гомогената помещают в стакан стеклянного гомогенизатора и продолжают дальнейшее измельчение ткани в течение 10 мин, а затем переносят его в центрифужный стакан или пробирку и центрифугируют в течение (25±5) мин в центрифуге с охлаждением при 5000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают в мерный цилиндр и измеряют ее объем. К осадку приливают второй экстрагирующий раствор в объеме, равном объему над-осадочной жидкости, и стеклянной палочкой хорошо перемешивают осадок с раствором. После перемешивания содержимое стакана или центрифужной пробирки переносят в стакан стеклянного гомогенизатора и проводят гомогенизацию осадка в течение 10 мин. не допуская поднятия температуры при гомогенизации в растворе выше 4СС. Гомогенат переносят в центрифужный стакан или пробирку и проводят центрифугирование в течение (25± ±5) мин в центрифуге с охлаждением при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость присоединяют к первому экстракту, перемешивают содержимое цилиндра стеклянной палочкой и измеряют общий объем объединенных экстрактов {V?).
0.1 см1 объединенного экстракта последовательно разводят охлажденной до 4°С подкисленной до рИ 4,0 водой в НО', 10*. 10* и 10* раз.
Из полученных разведений 10» и 10* отбирают по 0,25 см3 раствора и смешивают с равным количеством фосфатного буфера, содержащего 300 Ед/смэ нпгибитора протеаз.
3.7.3. Проведение испытания
В пробирки при комнатной температуре вносят растворы реагентов в последовательности и количестве, указанных в табл. 2.
Таблица 2
си'
Рихсиш й пор в дм я> ян ее оная . впиши, л пробит»:
т н К п
Буферные раствор 0.4 0.2 0,1 0.1
1251 -инсулин 0.1 0,1 а! 0.1
Калибровочные пробы Ка0,1 0,1
Определяемые пробы — _ 0.1
Антисыворотка _ _. 0.1 0,1
Иммуноглобулины — — 0.1
0,05 иоль/дн1 фосфатный
буфер — 0,1 0,1 —
Примечание. Т — общая активность 125*-инсулин», добавляемого в одну пробирку; Н — н«специфическое связывание для калибровки; К — калибровочные пробы;
П — определяемые пробы. ^ 3.7.4.2. За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое значение результатов двух параллельных определений, рассчитанное до второго и округленное до первого десятичного знака.
3.7.4.3. Допускаемое расхождение между результатами двух параллельных определений при Р = 0,95 не должно превышать 17% по отношению к среднему арифметическому значению.
3.7.4.4. Допускаемое расхождение между результатами испытаний, проведенных в двух разных лабораториях, при Р=0,У5 не должно превышать 20% по отношению к среднему арифметическому значению.
4. ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ
4.1. Транспортирование
Замороженные поджелудочные железы транспортируют всеми видами транспорта при температуре не выше Минус 2СгС в соответствии с правилами перевозок скоропортящихся грузов, действующими.на соответствующем виде транспорта. Транспортирование замороженных поджелудочных желез в пакетированном виде — по ГОСТ 24597. ГОСТ 21650. ГОСТ 26663. 4.2. Хранение
Замороженные поджелудочные железы .хранят в упакованном виде и камере при температуре не выше минус 204"..
Срок хранения замороженных поджелудочных желез — 6 мес с момента сбора.
Хранение замороженных поджелудочных желез на складах транспортных организаций не допускается.
Комментарии