Дата введении 01.01.77
Настоящий стандарт распространяется на мясо и субпродукты от всех видов убойного скота и устанавливает методы бактериологического исследования для выявления в них аэробных бактерий (бацилл сибирской язвы, бактерии из рода сальмонелл, бактерий из рода кишечной палочки-Эшери-хий, бактерий из рода протея, бактерий рожи свиней, бактерий листерноза, бактерий пастереллеза, бактерий из группы кокков) и анаэробных бактерий (патогенных и токсигеппых клостридий).
Бактериологическое исследование мяса и субпродуктов производят во всех случаях, предусмотренных действующей нормативно-технической документацией, правилами ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов и другими нормативными актами, а также по требованию органов, осуществляющих ветеринарный или санитарный надзор.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ
1.1. В зависимости от характера заболевания на бактериологическое исследование направляют от
туши:
- часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8 66 см;
- лимфатические узлы поверхностный шейный или собственно лодкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соединительной и жировой тканыо. а от свиней поверхностный шейный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый первого ребра и надколенный;
- долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.
Для бактериологического исследования на листериоз направляют: головной мозг, долю печени и почку.
Для бактериологического исследования на возбудителя сибирской язвы направляют лимфатический узел пораженного органа или лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации подозрительного фокуса, отечную ткань, ухо, а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел.
При исследовании полугуш или четвертин туш берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.
При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной таре, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические узлы сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость и рассол.
Примечав и е. Если берут часть печени, почки, селезенки, то поверхность разреза прижигают.
1.2. Образцы завертывают каждый в отдельности в полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354 или пергамент по ГОСТ 1341. помешают в бу мажный пакет, на котором ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию в обшей таре (ящике).
Настоящий стандарт распространяется на мясо и субпродукты от всех видов убойного скота и устанавливает методы бактериологического исследования для выявления в них аэробных бактерий (бацилл сибирской язвы, бактерии из рода сальмонелл, бактерий из рода кишечной палочки-Эшери-хий, бактерий из рода протея, бактерий рожи свиней, бактерий листерноза, бактерий пастереллеза, бактерий из группы кокков) и анаэробных бактерий (патогенных и токсигеппых клостридий).
Бактериологическое исследование мяса и субпродуктов производят во всех случаях, предусмотренных действующей нормативно-технической документацией, правилами ветеринарно-санитарной экспертизы мяса и мясопродуктов и другими нормативными актами, а также по требованию органов, осуществляющих ветеринарный или санитарный надзор.
1. МЕТОДЫ ОТБОРА ОБРАЗЦОВ
1.1. В зависимости от характера заболевания на бактериологическое исследование направляют от
туши:
- часть мышцы сгибателя или разгибателя передней и задней конечностей туши длиной не менее 8 см или кусок другой мышцы размером не менее 8 66 см;
- лимфатические узлы поверхностный шейный или собственно лодкрыльцовый и наружный подвздошный вместе с окружающей их соединительной и жировой тканыо. а от свиней поверхностный шейный дорзальный (при отсутствии патологических изменений в области головы и шеи) или подкрыльцовый первого ребра и надколенный;
- долю печени с печеночным лимфатическим узлом или желчным пузырем, освобожденным от желчи, почку и селезенку.
Для бактериологического исследования на листериоз направляют: головной мозг, долю печени и почку.
Для бактериологического исследования на возбудителя сибирской язвы направляют лимфатический узел пораженного органа или лимфатический узел, собирающий лимфу с места локализации подозрительного фокуса, отечную ткань, ухо, а у свиней, кроме того, подчелюстной лимфатический узел.
При исследовании полугуш или четвертин туш берут кусок мышцы, лимфатические узлы и трубчатую кость.
При исследовании соленого мяса, находящегося в бочечной таре, берут образцы мяса и имеющиеся лимфатические узлы сверху, из середины и со дна бочки, а также, при наличии, трубчатую кость и рассол.
Примечав и е. Если берут часть печени, почки, селезенки, то поверхность разреза прижигают.
1.2. Образцы завертывают каждый в отдельности в полиэтиленовую пленку по ГОСТ 10354 или пергамент по ГОСТ 1341. помешают в бу мажный пакет, на котором ставят дату отбора образца, номер туши и направляют в лабораторию в обшей таре (ящике).
ГОСТ 21237-75 С. 2
1.3. При необходимости пересылки образной в лабораторию, расположенную за пределами предприятия или хозяйства, где отбирают образцы, тару с образцами опечатывают или пломбируют. В сопроводительном документе указывают:
- наименование продукта с указанием вида мяса, от которого взят образец, и его количество:
- наименование предприятия или хозяйства, где отобран образец, и его адрес;
- номера образцов:
- причину направления образцов на исследование;
- краткие патологоаиатомические данные и предполагаемый диагноз:
- дату взятия образцов и полписьлипа. направившего их на исследование.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
2.1. Для проведения бактериологического исследования применяют:
автоклав:
аппарат Коха;
баню водяную с терморегулятором;
весы лабораторные обшего назначения по ГОСТ 24104:
весы торзионные;
гомогенизатор бактериологический или аппарат для измельчения тканей с числом оборотов не менее 8000 об/мин и не более 45000 об/мин; горелки газовые: дистиллятор:
котлы с паровой рубашкой; компаратор;
лупу с увеличением 3—5 по ГОСТ 25706:
микроскоп типа МБИ или МЫ' или других аналогичных марок:
мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;
ножи;
ножницы медицинские по ГОСТ 21239; осветитель ОИ-19;
пинцеты медицинские по ГОСТ 21241; потенниомегр или рН-метр;
спиртовки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336; термостат электрический с автоматическим регулятором; ультратермостат;
флаконы Сокслета (бутылки для детского питания); холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317; часы песочные по ОСТ 25—11—38 на 1, 2, 5 и 15 мин; шкаф сушильный электрический лабораторный; бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026: бутылки стеклянные;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556; воду бромную;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709; воду питьевую по ГОСТ 2874*;
воронки стеклянные по ГОСТ 25336. конусообразные, вместимостью 250. 500 см'; дрожжи прессованные по ГОСТ 171;
желчь крупного рогатого скота свежую или сухую обезвоженную; кастрюли;
колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336: кровь крупного рогатого скота, овен, лошадей; марлю медицинскую по ГОСТ 9412; масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164; масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
* На территории Российской Фслсраиии действует ГОСТ Р 51232—98.
IJ-2264
1.3. При необходимости пересылки образной в лабораторию, расположенную за пределами предприятия или хозяйства, где отбирают образцы, тару с образцами опечатывают или пломбируют. В сопроводительном документе указывают:
- наименование продукта с указанием вида мяса, от которого взят образец, и его количество:
- наименование предприятия или хозяйства, где отобран образец, и его адрес;
- номера образцов:
- причину направления образцов на исследование;
- краткие патологоаиатомические данные и предполагаемый диагноз:
- дату взятия образцов и полписьлипа. направившего их на исследование.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ
2.1. Для проведения бактериологического исследования применяют:
автоклав:
аппарат Коха;
баню водяную с терморегулятором;
весы лабораторные обшего назначения по ГОСТ 24104:
весы торзионные;
гомогенизатор бактериологический или аппарат для измельчения тканей с числом оборотов не менее 8000 об/мин и не более 45000 об/мин; горелки газовые: дистиллятор:
котлы с паровой рубашкой; компаратор;
лупу с увеличением 3—5 по ГОСТ 25706:
микроскоп типа МБИ или МЫ' или других аналогичных марок:
мясорубку бытовую по ГОСТ 4025;
ножи;
ножницы медицинские по ГОСТ 21239; осветитель ОИ-19;
пинцеты медицинские по ГОСТ 21241; потенниомегр или рН-метр;
спиртовки стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336; термостат электрический с автоматическим регулятором; ультратермостат;
флаконы Сокслета (бутылки для детского питания); холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317; часы песочные по ОСТ 25—11—38 на 1, 2, 5 и 15 мин; шкаф сушильный электрический лабораторный; бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026: бутылки стеклянные;
вату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556; воду бромную;
воду дистиллированную по ГОСТ 6709; воду питьевую по ГОСТ 2874*;
воронки стеклянные по ГОСТ 25336. конусообразные, вместимостью 250. 500 см'; дрожжи прессованные по ГОСТ 171;
желчь крупного рогатого скота свежую или сухую обезвоженную; кастрюли;
колбы стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336: кровь крупного рогатого скота, овен, лошадей; марлю медицинскую по ГОСТ 9412; масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164; масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
* На территории Российской Фслсраиии действует ГОСТ Р 51232—98.
IJ-2264
С. II ГОСТ 21237-75
мел химически осажденный по ГОСТ 6253; мясо-говядину по ГОСТ 779; панкреатин пищевой сухой; пенициллин;
пептон венгерской фирмы «Рихтер»;
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805; пептон чешской фирмы «Спофа»; петледержатели; печень говяжью;
пипетки вместимостью I. 2 см5 с ценой деления 0,05 и 0,1 см1 и вместимостью 10 см*;
плазму нитратную кроличью сухую;
железу поджелудочную крупного рогатого скота;
поплавки для пробирок и колб длиной 20. 45 и 75 мм. диаметром соответственно 2, 5 и 10 мм: посуду мерную стеклянную по ГОСТ 1770;
набор агглютинирующих адсорбированных сальмонеллезных сывороток: поливалентной О-сыво-ротки групп А. В, С. О и £' и моновалентных О- и Н-сывороток; пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336; пробки корковые по ГОСТ 5541; пробки резиновые:
проволоку из никелевых сплавов диаметром 0.3—0.5 мм по ГОСТ 1791;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962* или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
спирт денатурированный;
стекла покровные по ГОСТ6672;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
ступки фарфоровые с пестиками по ГОСТ 9147;
хлороформ технический по ГОСТ 20015;
цилиндры вместимостью 100. 250, 500 см' по ГОСТ 1770;
чашки с крышками стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 (чашки Петри);
штативы для пробирок:
шумовку:
эозин бактериологический;
яйца куриные;
бриллиантовый зеленый:
бромтимоловый синий;
генциан фиолетовый (генннанвиолет);
глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;
Д-глюкозу по ГОСТ 6038. Д (+). х.ч.;
желатин по ГОСТ 11293;
йод металлический по ГОСТ 4159. х.ч.;
калий йодистый по ГОСТ 4232. х.ч.;
калий фосфорнокислый двузамешенный по ГОСТ 2493. х.ч.; калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.: кислоту карболовую кристаллическую; кислоту фосфорную по ГОСТ 6552; кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет); лактозу, х.ч.;
магний сернокислый по ГОСТ 4523. х.ч.; магний хлористый по ГОСТ 4209, х.ч.; манпит (манннтол) по ТУ 6—09—5484. х.ч., Д ( ): синь метиленовую;
метиловый красный по ТУ 6—09—5169: метиловый фиолетовый медицинский (мегилвиолет): мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652—2000.
пептон венгерской фирмы «Рихтер»;
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805; пептон чешской фирмы «Спофа»; петледержатели; печень говяжью;
пипетки вместимостью I. 2 см5 с ценой деления 0,05 и 0,1 см1 и вместимостью 10 см*;
плазму нитратную кроличью сухую;
железу поджелудочную крупного рогатого скота;
поплавки для пробирок и колб длиной 20. 45 и 75 мм. диаметром соответственно 2, 5 и 10 мм: посуду мерную стеклянную по ГОСТ 1770;
набор агглютинирующих адсорбированных сальмонеллезных сывороток: поливалентной О-сыво-ротки групп А. В, С. О и £' и моновалентных О- и Н-сывороток; пробирки стеклянные бактериологические по ГОСТ 25336; пробки корковые по ГОСТ 5541; пробки резиновые:
проволоку из никелевых сплавов диаметром 0.3—0.5 мм по ГОСТ 1791;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962* или спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
спирт денатурированный;
стекла покровные по ГОСТ6672;
стекла предметные по ГОСТ 9284;
ступки фарфоровые с пестиками по ГОСТ 9147;
хлороформ технический по ГОСТ 20015;
цилиндры вместимостью 100. 250, 500 см' по ГОСТ 1770;
чашки с крышками стеклянные лабораторные по ГОСТ 25336 (чашки Петри);
штативы для пробирок:
шумовку:
эозин бактериологический;
яйца куриные;
бриллиантовый зеленый:
бромтимоловый синий;
генциан фиолетовый (генннанвиолет);
глицерин по ГОСТ 6259, х.ч.;
Д-глюкозу по ГОСТ 6038. Д (+). х.ч.;
желатин по ГОСТ 11293;
йод металлический по ГОСТ 4159. х.ч.;
калий йодистый по ГОСТ 4232. х.ч.;
калий фосфорнокислый двузамешенный по ГОСТ 2493. х.ч.; калий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 4198, х.ч.: кислоту карболовую кристаллическую; кислоту фосфорную по ГОСТ 6552; кристаллический фиолетовый (кристаллвиолет); лактозу, х.ч.;
магний сернокислый по ГОСТ 4523. х.ч.; магний хлористый по ГОСТ 4209, х.ч.; манпит (манннтол) по ТУ 6—09—5484. х.ч., Д ( ): синь метиленовую;
метиловый красный по ТУ 6—09—5169: метиловый фиолетовый медицинский (мегилвиолет): мочевину по ГОСТ 6691, х.ч.;
* На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 51652—2000.
ГОСТ 21237-75 С. 4
набор углеводов,гая исследования ферментации микробов кишечной группы (большой);
натрий-аммоний фосфорнокислый по ГОСТ 4170;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201, х.ч.;
натрий кислый селенистокислый (без теллура);
натрий лимоннокислый по ГОСТ 222X0;
натрий сернистокислый (сульфит натрия) безводный по ГОСТ 195. х.ч.: тиосульфат натрия по ["ОСТ 27068. х.ч.;
натрий фосфорнокислый двузамешенный безводный по ГОСТ 11773. х.ч.;
натрий фосфорнокислый однозамещениый по ГОСТ 245, х.ч.;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;
па ради мети л а м и добе н зал цае гид;
сафранин;
сахарозу по ГОСТ 5833. х.ч.: свинец уксуснокислый по ГОС Т 1027;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую (соль Мора) по ГОСТ 4208: фенол:
феноловый красный по ТУ 6—09—5170. х.ч.: фуксин кислый для микробиологических целей; фуксин основной для микробиологических целей; агар микробиологический по ГОСТ 17206: агар сухой питательный; агар Плоскирева сухой бактериологический; агар сухой висмут-сульфит;
агар сухой с эозин-метиленовым синим (среда Левина);
воду мясную по ГОСТ 20729;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
диализат или эксгракт дрожжевой;
раствор Хенкса;
сальмонеллезный О-бактериофаг; сибиреязвенный фаг «гамма МВА». (Измененная редакция, Изд. № 1, 2).
3. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ
3.1. Приготовление питательных сред, реактивов, красок
3.1.1. Приготовление мясо-пептон лого агара
К 1000 см' мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.
Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50—55 "С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см' мясо-пептонного агара), помешают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч. чтобы белок свернулся и. оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марле вый фильтр, устанавливают в нем рН 7.0 -7,4. разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120 "С.
3.1.2. Приготовление основного раствора Хоттингера
1000 г мяса, освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками размером 1—2 см и опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15—20 мин, пока цвет мяса не станет серым; это указывает па то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и измельчают на мясорубке. Оставшуюся жидкость фильтру ют и в ней устанавливают рН 8,0. Фарш опускают в отфильтрованную жидкость и охлаждают до температуры 40 "С в открытой кастрюле, затем добавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды измельченную поджелудочную железу в количестве 10 % к полученной взвеси (на 1000 см5 жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0.5— 1.0 % (в зависимости от его активности). Полученную смесь хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают К) %-ным раствором гидроокиси натрия до рН 7,8 8,0 и повторяют такое же подщелачивание через 30 мин. Отсутствие сдвига реакции смеси укашвают на его доброкачественность.
1.1'
натрий-аммоний фосфорнокислый по ГОСТ 4170;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201, х.ч.;
натрий кислый селенистокислый (без теллура);
натрий лимоннокислый по ГОСТ 222X0;
натрий сернистокислый (сульфит натрия) безводный по ГОСТ 195. х.ч.: тиосульфат натрия по ["ОСТ 27068. х.ч.;
натрий фосфорнокислый двузамешенный безводный по ГОСТ 11773. х.ч.;
натрий фосфорнокислый однозамещениый по ГОСТ 245, х.ч.;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;
па ради мети л а м и добе н зал цае гид;
сафранин;
сахарозу по ГОСТ 5833. х.ч.: свинец уксуснокислый по ГОС Т 1027;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую (соль Мора) по ГОСТ 4208: фенол:
феноловый красный по ТУ 6—09—5170. х.ч.: фуксин кислый для микробиологических целей; фуксин основной для микробиологических целей; агар микробиологический по ГОСТ 17206: агар сухой питательный; агар Плоскирева сухой бактериологический; агар сухой висмут-сульфит;
агар сухой с эозин-метиленовым синим (среда Левина);
воду мясную по ГОСТ 20729;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
диализат или эксгракт дрожжевой;
раствор Хенкса;
сальмонеллезный О-бактериофаг; сибиреязвенный фаг «гамма МВА». (Измененная редакция, Изд. № 1, 2).
3. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ
3.1. Приготовление питательных сред, реактивов, красок
3.1.1. Приготовление мясо-пептон лого агара
К 1000 см' мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.
Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50—55 "С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см' мясо-пептонного агара), помешают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч. чтобы белок свернулся и. оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марле вый фильтр, устанавливают в нем рН 7.0 -7,4. разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120 "С.
3.1.2. Приготовление основного раствора Хоттингера
1000 г мяса, освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками размером 1—2 см и опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15—20 мин, пока цвет мяса не станет серым; это указывает па то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и измельчают на мясорубке. Оставшуюся жидкость фильтру ют и в ней устанавливают рН 8,0. Фарш опускают в отфильтрованную жидкость и охлаждают до температуры 40 "С в открытой кастрюле, затем добавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды измельченную поджелудочную железу в количестве 10 % к полученной взвеси (на 1000 см5 жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0.5— 1.0 % (в зависимости от его активности). Полученную смесь хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают К) %-ным раствором гидроокиси натрия до рН 7,8 8,0 и повторяют такое же подщелачивание через 30 мин. Отсутствие сдвига реакции смеси укашвают на его доброкачественность.
1.1'
С. II ГОСТ 21237-75
После установления рН смесь переливают в бутыль с хорошо подобранной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы 'Д часть бутылки оставалась свободной. Затем добавляют в количестве I—3 % от объема хлороформа (в холодное время года меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают, после чего вынимают пробку для удаления избытка хлороформа и тут же снова закрывают.
Через 1—2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают рН 7.4—7.6 и оставляют смесь для переваривания на 7—16 суток при комнатной температуре до образования аморфного осадка.
Первые 3 4 суток переваривания ежедневно проверяют реакцию среды и поддерживают рН на уровне 7.4—7.6. В течение этого времени встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки так же. как указано выше. В дальнейшем встряхивать можно реже.
За 1—2 суток до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки собирается аморфный осадок; жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет; гидролизат легко фильтруется; реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3—4 см1 фильтрованного гндролизата, добавляют три-четыре капли бромной воды): при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет, в то время как контрольная пробирка с гидролнзатом без бромной воды имеет желтое окрашивание. 5 %-ный гидролизат должен содержать 1.1 1.2% общего азота. 11осле гидролиза жидкость фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 'С.
Приготовленную среду можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость фильтруют.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.3. Приготовление бульона Хоттингера
К 100 см* основного раствора добавляют 500 см1 водопроводной воды. 3 г хлористого натрия и 0,12 гдвузамешенного фосфорнокислого калия. Полученный раствор кипятят в течение 10 мин, фильтруют, устанавливают рН 7,2—7,4 и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 С.
3.1.4. Приготовление физиологического раствора
В 1000 см1 дистиллированной воды растворяют N.5 г химически чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 'С.
3.1.5. Приготовление среды Левина
К 100 см1 расплавленного мясо-пептонного агара с рН 7,0—7,4, приготовленного по п. 3.1.1. добавляют 2 см 0,5 %-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 см 2 %-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0.2 гдвузамешенного фосфорнокислого калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100 "С. 11осле добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают. разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.
Среда Левина может быть приготовлена из сухой стандартной среды по прописи, указанной на этикетке.
3.1.6. Среды фуксин-сульфитный агар (среда Эндо), бактоагар Плоскирева, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) могут быть приготовлены из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.
3.1.7. Приготовление среды Мюллера
Для приготоатения среды Мюллера вначале готовят растворы серноватисгокислого натрия и Люголя.
В мерный цилиндр с 50 г серноватисгокислого натрия добавляют до 100 см' дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.
Ятя приготовления раствора Люголя в 100 см1 дистиллированной воды растворяют 25 г металлического йода. 20 г йодистого калия.
Для приготовления среды Мюллера в стерильные флаконы помешают по 4.5 г мела и стерилизуют их сухим паром в течение 1 ч. Затем наливают в каждый флакон по 90 см' бульона из перевара Хоттингера. содержащего 0,13—0,15 % ам и иного азота, устанавливают рН 7.2-7.4 и стерилизуют при температуре 120 С. После стерилизации вновь устанаатнвают рН 7.2—7.4. для чего проверяют в одном из флаконов и определяют необходимый для подтитровкн данного количества среды объем соляной кислоты или гидроокиси натрия. Затем в асептических условиях перед употреблением добааляют по 2 см* раствора Люголя и по 10 ел«1 раствора серноватисгокислого натрия.
Через 1—2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают рН 7.4—7.6 и оставляют смесь для переваривания на 7—16 суток при комнатной температуре до образования аморфного осадка.
Первые 3 4 суток переваривания ежедневно проверяют реакцию среды и поддерживают рН на уровне 7.4—7.6. В течение этого времени встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки так же. как указано выше. В дальнейшем встряхивать можно реже.
За 1—2 суток до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки собирается аморфный осадок; жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет; гидролизат легко фильтруется; реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3—4 см1 фильтрованного гндролизата, добавляют три-четыре капли бромной воды): при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет, в то время как контрольная пробирка с гидролнзатом без бромной воды имеет желтое окрашивание. 5 %-ный гидролизат должен содержать 1.1 1.2% общего азота. 11осле гидролиза жидкость фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 'С.
Приготовленную среду можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость фильтруют.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.3. Приготовление бульона Хоттингера
К 100 см* основного раствора добавляют 500 см1 водопроводной воды. 3 г хлористого натрия и 0,12 гдвузамешенного фосфорнокислого калия. Полученный раствор кипятят в течение 10 мин, фильтруют, устанавливают рН 7,2—7,4 и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 С.
3.1.4. Приготовление физиологического раствора
В 1000 см1 дистиллированной воды растворяют N.5 г химически чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 'С.
3.1.5. Приготовление среды Левина
К 100 см1 расплавленного мясо-пептонного агара с рН 7,0—7,4, приготовленного по п. 3.1.1. добавляют 2 см 0,5 %-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 см 2 %-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0.2 гдвузамешенного фосфорнокислого калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100 "С. 11осле добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают. разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.
Среда Левина может быть приготовлена из сухой стандартной среды по прописи, указанной на этикетке.
3.1.6. Среды фуксин-сульфитный агар (среда Эндо), бактоагар Плоскирева, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) могут быть приготовлены из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.
3.1.7. Приготовление среды Мюллера
Для приготоатения среды Мюллера вначале готовят растворы серноватисгокислого натрия и Люголя.
В мерный цилиндр с 50 г серноватисгокислого натрия добавляют до 100 см' дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.
Ятя приготовления раствора Люголя в 100 см1 дистиллированной воды растворяют 25 г металлического йода. 20 г йодистого калия.
Для приготовления среды Мюллера в стерильные флаконы помешают по 4.5 г мела и стерилизуют их сухим паром в течение 1 ч. Затем наливают в каждый флакон по 90 см' бульона из перевара Хоттингера. содержащего 0,13—0,15 % ам и иного азота, устанавливают рН 7.2-7.4 и стерилизуют при температуре 120 С. После стерилизации вновь устанаатнвают рН 7.2—7.4. для чего проверяют в одном из флаконов и определяют необходимый для подтитровкн данного количества среды объем соляной кислоты или гидроокиси натрия. Затем в асептических условиях перед употреблением добааляют по 2 см* раствора Люголя и по 10 ел«1 раствора серноватисгокислого натрия.
ГОСТ 21237-75 С. 6
3.1.8. Приготовление среды К а у ф м а н а
К 500 см' стерильной среды Мюллера, приготовленной по п. 3.1.7, лобаатяют 25 см1 стерильной желчи крупного рогатого скота и 5 см' 0.1 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени. Смесь хорошо взбалтывают, разливают в стерильные флаконы, но не стерилизуют.
3.1.9. Приготовление селенитового Ф-б у л ь о и а
Среду готовят из двух основных растворов А и Б.
Раствор А состоит из 5 г пептона чешской фирмы «Спофа» или венгерской фирмы «Рихтер», 7 г безводного двузамешенного фосфорнокислого натрия. 3 г однозамешенного фосфорнокислого натрия, 4 г х.ч. лактозы, 100 см' дистиллированной воды. рН раствора 6.9—7.1. Раствор стерилизуют 30 мин при температуре 112 'С.
Раствор Б состоит из 10 %-ного раствора кислого селенистокислого натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
При изменении серии любого из входящих вереду компонентов (пептона, кислого селенистокислого натрия, фосфатов) проводят предварительно подтитровку. для чего экспериментально определяют точную пропорцию фосфорнокислого двузамешенного безводного натрия и фосфорнокислого однозамешенного натрия, которая с используемыми образцами пептона и селенистокислого натрия дает рН не выше 6.9—7,1, что регулируется изменением соотношения фосфатов.
Для приготовления селенитовой среды к 50 см* раствора А стерильно добавляют 2 см' раствора Б. Среду разливают в стерильные флаконы или колбы, но не стерилизуют.
3.1.10. Приготовление хлор и сто магниевой среды «М» (модифи-II н р о в а н н о й)
Среду готовят из трех основных раст воров А. Б и В.
Для приготовления раствора А в 90 см5 дистиллированной воды растворяют 0,42 г сухого ферментативного пептона, 0.7 г хлористого натрия, 0.15 г однозамешенного фосфорнокислого калия, 4 см* дрожжевого диализата.
Для приготовления раствора Б в 9 см' дистиллированной воды растворяют 3.6 г кристаллического хлористого магния.
Раствор В состоит из 0.09 см15 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени.
Дтя приготовления хлористомагниевой среды «М» (модифицированной) растворы А, Б и В смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112.5 "С.
Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.
При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.
3.1.11. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2000 см* дистиллированной воды растворяют 1000 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4 "С в течение 5—6 суток.
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см 0.01 %-ного раствора кристаллического фиолетового, разливают во флаконы или пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 'С в течение 30 мин. Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4 6 'С до двух недель.
3.1.12. Приготовление среды К и л л и а и а
К 100 см' стерильного питательного бульона (рН 6,8—6,9) стерильно лобаатяют I см '0,1 %-пого раствора бриллиантовой зелени. Раствор бриллиантовой зелени готовят следующим образом: 0.1 г бриллиантовой зелени заливают 100 см1 дистиллированной воды, помешают во флаконы с резиновой или корковой пробкой и помешают в термостат при температуре 37 'С на сутки.
3.1.13. Приготовление т р е х с а х а р и о г о агара с мочевиной (К р у м в и д е-О лькеницкого в модификации К о в а л ь ч у к а)
В 1000 см1 дистиллированной поды растворяют 2 г глюкозы, 3,5 г сахарозы, 15 г лактозы, 0,6 г соли Мора, 1 г серноватистокислого натрия и 10 г мочевины. Соль Мора и серноватистокислый натрий предварительно растворяют в 5—7 см* дистиллированной воды в пробирках. Углеводы и мочевину также растворяют в 10 см' д испил нрованной воды в колбе на водяной бане. До с терпли зации устанавливают рН 7.4 7,6 и добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором «ВР». Раствор размешивают и кипятят до расплаатения агара, разливают в пробирки по 5—6 см' в каждую. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром 2 для по 30 мин или при температуре 112 *С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают так. чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см).
3.1.8. Приготовление среды К а у ф м а н а
К 500 см' стерильной среды Мюллера, приготовленной по п. 3.1.7, лобаатяют 25 см1 стерильной желчи крупного рогатого скота и 5 см' 0.1 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени. Смесь хорошо взбалтывают, разливают в стерильные флаконы, но не стерилизуют.
3.1.9. Приготовление селенитового Ф-б у л ь о и а
Среду готовят из двух основных растворов А и Б.
Раствор А состоит из 5 г пептона чешской фирмы «Спофа» или венгерской фирмы «Рихтер», 7 г безводного двузамешенного фосфорнокислого натрия. 3 г однозамешенного фосфорнокислого натрия, 4 г х.ч. лактозы, 100 см' дистиллированной воды. рН раствора 6.9—7.1. Раствор стерилизуют 30 мин при температуре 112 'С.
Раствор Б состоит из 10 %-ного раствора кислого селенистокислого натрия, приготовленного на стерильной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.
При изменении серии любого из входящих вереду компонентов (пептона, кислого селенистокислого натрия, фосфатов) проводят предварительно подтитровку. для чего экспериментально определяют точную пропорцию фосфорнокислого двузамешенного безводного натрия и фосфорнокислого однозамешенного натрия, которая с используемыми образцами пептона и селенистокислого натрия дает рН не выше 6.9—7,1, что регулируется изменением соотношения фосфатов.
Для приготовления селенитовой среды к 50 см* раствора А стерильно добавляют 2 см' раствора Б. Среду разливают в стерильные флаконы или колбы, но не стерилизуют.
3.1.10. Приготовление хлор и сто магниевой среды «М» (модифи-II н р о в а н н о й)
Среду готовят из трех основных раст воров А. Б и В.
Для приготовления раствора А в 90 см5 дистиллированной воды растворяют 0,42 г сухого ферментативного пептона, 0.7 г хлористого натрия, 0.15 г однозамешенного фосфорнокислого калия, 4 см* дрожжевого диализата.
Для приготовления раствора Б в 9 см' дистиллированной воды растворяют 3.6 г кристаллического хлористого магния.
Раствор В состоит из 0.09 см15 %-ного водного раствора бриллиантовой зелени.
Дтя приготовления хлористомагниевой среды «М» (модифицированной) растворы А, Б и В смешивают и стерилизуют 30 мин при температуре 112.5 "С.
Концентрированную среду готовят, удваивая содержание всех компонентов, кроме дистиллированной воды.
При отсутствии дрожжевого диализата допускается применять дрожжевой экстракт.
3.1.11. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2000 см* дистиллированной воды растворяют 1000 г прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4 "С в течение 5—6 суток.
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2,5 см 0.01 %-ного раствора кристаллического фиолетового, разливают во флаконы или пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 'С в течение 30 мин. Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4 6 'С до двух недель.
3.1.12. Приготовление среды К и л л и а и а
К 100 см' стерильного питательного бульона (рН 6,8—6,9) стерильно лобаатяют I см '0,1 %-пого раствора бриллиантовой зелени. Раствор бриллиантовой зелени готовят следующим образом: 0.1 г бриллиантовой зелени заливают 100 см1 дистиллированной воды, помешают во флаконы с резиновой или корковой пробкой и помешают в термостат при температуре 37 'С на сутки.
3.1.13. Приготовление т р е х с а х а р и о г о агара с мочевиной (К р у м в и д е-О лькеницкого в модификации К о в а л ь ч у к а)
В 1000 см1 дистиллированной поды растворяют 2 г глюкозы, 3,5 г сахарозы, 15 г лактозы, 0,6 г соли Мора, 1 г серноватистокислого натрия и 10 г мочевины. Соль Мора и серноватистокислый натрий предварительно растворяют в 5—7 см* дистиллированной воды в пробирках. Углеводы и мочевину также растворяют в 10 см' д испил нрованной воды в колбе на водяной бане. До с терпли зации устанавливают рН 7.4 7,6 и добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором «ВР». Раствор размешивают и кипятят до расплаатения агара, разливают в пробирки по 5—6 см' в каждую. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют текучим паром 2 для по 30 мин или при температуре 112 *С в течение 20 мин. После стерилизации среду скашивают так. чтобы остался небольшой столбик (не менее 3 см).
С. II ГОСТ 21237-75
3.1.14. Приготовление пептон н о-у гл е в о д и ы х сред (среды Г и с с а)
К 100 см® дистиллированной воды прибавляют 1 г сухого ферментативного пептона. 0.5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор. пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают pH 0.7. прибавляют 0.5 г углевода и 1 см3 индикатора Лндреде.
Среду разливают по 5 см1 в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре 110 "С. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка. Можно использовать готовые среды Гисса.
Для приготовления индикатора Андреде к 100 см1 дистиллированной воды добавляют 16,4 см1 1 моль/дм* раствора гидроокиси натрия и 0.5 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при температуре 110— 112 'С. Индикатор хранят в склянке из темного стекла.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.15. Приготовление пептон ной воды
К 1000 смЛ дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают pH 7.2 7.4. после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120 С.
3.1.16. Приготовление плазмы крови
В пробирку вносят 2 см1 5 %-пого расгвора лимоннокислого натрия и К см1 только что полученной крови кролика. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник при температуре 4—6 'С или подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин. В результате чего над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета плазмы, котору ю разводят физиологическим раствором 1:4.
3.1.17. Приготовление д с ф и б р и н и р о в а н н о й крови
В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см' только что взятой крови кролика, барана, лошади и непрерывно встряхивают в течение 10 15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивает бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринироваппая кровь утрачивает способность свертываться.
3.1.18. Приготовление кровяного агара
К 100 см1 расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.1.1 и охлажденного до температуры 45 "С, стерильно прибавляют 5—10 см' стерильно взятой дефнбрнниро-ванной крови. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, дают ей застыл, и подсушивают в термостате при температуре 37 С. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.
3.1.19. Приготовление агара С и м мопса
В 1000 см* дистиллированной воды растворяют 5 г хлористого натрия, 0.2 г сернокислого магния. 1.5 г фосфорнокислого натрия-аммония. 2 г двузамешепного фосфорнокиоого калия, 5 г нейтрального лимоннокислого натрия. 20 г агара. Раствор фильтруют, добавляют 40 см' раствора бром тимолового синего (1:500). Среду рагчивают в пробирки по 5 6 см4 в каждую, стерилизуют при температуре 120 'С в течение 20 мин, после чего скашивают. Готовая среда должна быть оливкового цвета.
3.1.20. Приготовление среды Государственного контрольного института (ГКИ)
В стерильную колбу наливают 60 см' раствора Хенкса и добавляют стерильно 40 см сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при температуре 56 С в течение 30 мин. После тщательною перемешивания устанавливают pH 7,2 раствором двууглекислого натрия и разливают среду по 2 см' в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными резиновыми пробками. Среду можно хранить при температуре 4 С до четырех месяцев.
3.1.21. Приготовление среды Д р о ж ж е в к и н о й
К 10 см' стерильного желтка куриного яйца добавляют 90 см физиологического раствора, тщательно перемешивают. Смесь разливают по 8 см в стерильные пробирки. Перед употреблением проверяют стерильность среды, поместив ее в термостат при температу ре 37 "С на 48 ч.
3.1.22. Приготовление среды Кит т-Т а р о ц ц и
Свежую печень крупного рогатого скота разрезают на куски массой по 50—60 г, заливают равным количеством воды и кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании. Печеночный экстракт фильтруют через ватпо-марлевый фильтр и смешивают с мясо-пептонпым бульоном из расчета одна часть печеночного экстракта на грн части бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют хлористый натрий из расчета 1.25 г на 1000 см1 среды и устанавливают pH 7,6 7,8. после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный фильтр.
К 100 см® дистиллированной воды прибавляют 1 г сухого ферментативного пептона. 0.5 г хлористого натрия и нагревают до растворения, затем фильтруют до тех пор. пока раствор не станет совершенно прозрачным. Устанавливают pH 0.7. прибавляют 0.5 г углевода и 1 см3 индикатора Лндреде.
Среду разливают по 5 см1 в пробирки с поплавками и стерилизуют 20 мин при температуре 110 "С. Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка. Можно использовать готовые среды Гисса.
Для приготовления индикатора Андреде к 100 см1 дистиллированной воды добавляют 16,4 см1 1 моль/дм* раствора гидроокиси натрия и 0.5 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при температуре 110— 112 'С. Индикатор хранят в склянке из темного стекла.
(Измененная редакция, Изм. № 2).
3.1.15. Приготовление пептон ной воды
К 1000 смЛ дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия, кипятят до растворения пептона, фильтруют и устанавливают pH 7.2 7.4. после чего стерилизуют 30 мин при температуре 120 С.
3.1.16. Приготовление плазмы крови
В пробирку вносят 2 см1 5 %-пого расгвора лимоннокислого натрия и К см1 только что полученной крови кролика. Цитратную кровь ставят на 18—20 ч в холодильник при температуре 4—6 'С или подвергают центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин. В результате чего над осадком эритроцитов образуется прозрачный слой жидкости желтоватого цвета плазмы, котору ю разводят физиологическим раствором 1:4.
3.1.17. Приготовление д с ф и б р и н и р о в а н н о й крови
В колбу со стеклянными бусами сливают 8 см' только что взятой крови кролика, барана, лошади и непрерывно встряхивают в течение 10 15 мин, в результате чего находящийся в крови фибрин выпадает в осадок, обволакивает бусы. Дефибринированную кровь сливают в другую колбу или пробирку. Слитая дефибринироваппая кровь утрачивает способность свертываться.
3.1.18. Приготовление кровяного агара
К 100 см1 расплавленного стерильного мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.1.1 и охлажденного до температуры 45 "С, стерильно прибавляют 5—10 см' стерильно взятой дефнбрнниро-ванной крови. Готовую среду разливают в стерильные чашки Петри, дают ей застыл, и подсушивают в термостате при температуре 37 С. Слой агара должен быть равномерно окрашен в красный цвет.
3.1.19. Приготовление агара С и м мопса
В 1000 см* дистиллированной воды растворяют 5 г хлористого натрия, 0.2 г сернокислого магния. 1.5 г фосфорнокислого натрия-аммония. 2 г двузамешепного фосфорнокиоого калия, 5 г нейтрального лимоннокислого натрия. 20 г агара. Раствор фильтруют, добавляют 40 см' раствора бром тимолового синего (1:500). Среду рагчивают в пробирки по 5 6 см4 в каждую, стерилизуют при температуре 120 'С в течение 20 мин, после чего скашивают. Готовая среда должна быть оливкового цвета.
3.1.20. Приготовление среды Государственного контрольного института (ГКИ)
В стерильную колбу наливают 60 см' раствора Хенкса и добавляют стерильно 40 см сыворотки крови крупного рогатого скота, прогретой при температуре 56 С в течение 30 мин. После тщательною перемешивания устанавливают pH 7,2 раствором двууглекислого натрия и разливают среду по 2 см' в стерильные пробирки, которые закрывают стерильными резиновыми пробками. Среду можно хранить при температуре 4 С до четырех месяцев.
3.1.21. Приготовление среды Д р о ж ж е в к и н о й
К 10 см' стерильного желтка куриного яйца добавляют 90 см физиологического раствора, тщательно перемешивают. Смесь разливают по 8 см в стерильные пробирки. Перед употреблением проверяют стерильность среды, поместив ее в термостат при температу ре 37 "С на 48 ч.
3.1.22. Приготовление среды Кит т-Т а р о ц ц и
Свежую печень крупного рогатого скота разрезают на куски массой по 50—60 г, заливают равным количеством воды и кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании. Печеночный экстракт фильтруют через ватпо-марлевый фильтр и смешивают с мясо-пептонпым бульоном из расчета одна часть печеночного экстракта на грн части бульона. Смесь нагревают до кипения, добавляют хлористый натрий из расчета 1.25 г на 1000 см1 среды и устанавливают pH 7,6 7,8. после чего кипятят в течение 15 мин и фильтруют через бумажный фильтр.
ГОСТ 21237-75 С. 8
В пробирки кладут мелко нарезанные кусочки печени по 1,5—2 г и заливают смесью печеночного экстракта с мясо-пептонным бульоном. На поверхность среды наслаивают 0.5 — 1 см вазелинового масла. Среду стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 "С.
3.1.23. Разведение пенициллина
На каждые 100 тыс. ед. пенициллина добавляют 1 см1 стерильной дистиллированной воды и получают основное разведение, содержащее 100 тыс. ед. пенициллина в 1 см'. Например, во флакон, содержащий 500 тыс. ел. пенициллина, нужно внести 5 см' дистиллированной воды.
В пять пробирок наливают по 4.5 см' в каждую стерильной дистиллированной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 см5 пенициллина основного разведения и получают впервой пробирке разведение, содержащее 10 тыс. ед. пенициллина в I см1 раствора. Новой пипеткой из первой пробирки, тщательно перемешав содержимое, переносят 0.5 см' раствора во вторую пробирку и получают разведение, содержащее 1000 ед. пенициллина в 1 см раствора. Таким же образом из второй пробирки переносят в третью 0.5 см' и получают разведение, содержащее 100 ед. пенициллина в 1 см* раствора. Изтретьей пробирки переносят0.5 см в четвертую и получают разведение, содержащее 10 ед. в I см' раствора. Из четвертой пробирки переносят 0.5 см' в пятую и получают в пятой пробирке разведение, содержащее I ед. пенициллина в I см* раствора.
3.1.24. Приготовление м я с о-п ептонного агара с п е н и ц и л л и н о м
В три колбочки или большие пробирки, содержащие по 20 см-4 стерильного расплавленного и
охлажденного до температуры 45—50'С мясо-пептонного агара (рН 7,2). добавляют в первую колбу I см' пенициллина из четвертой пробирки (см. п. 3.1.23), содержащей в I см' 10 ед. пенициллина, тшательно перемешивают, получают агар, содержащий 0,5 ед. пенициллина в I см', во вторую колбу вносят I см' из пятой пробирки (см. п. 3.1.23), содержащей в 1 см' 1 ед. пенициллина, получают агар, который содержит в 1 см5 0,05 ед. пенициллина; третью колбочку оставляют без пенициллина для контроля. Содержимое всех трех колбочек разливают в стерильные пробирки но 5 см' в каждую и скашивают.
3.1.25. Приготовление индикаторной бумаги для определения индола
5 г парадиметиламидобензальдегида, 10 см1 очищенной концентрированной фосфорной кислоты растворяют в 50 см' 96' спирта. В тепловатом растворе смачивают фильтровальную бумагу, высушивают. нарезают узкими полосками. Цвет бумаги - желтый. При наличии индола цвет бумаги меняется от сиреневато-розового до интенсивно малинового. Появление других цветов на индикаторной бумаге не учитывают.
3.1.26. Приготовление индикаторной бумаги для определения сероводорода
В 100 см' дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислого натрия. Этим раствором пропитывают полоски фильтровальной бумаги, высушивают их при температуре 18—23 "С и нарезают на узкие полоски. После приготовления бумага остается белой: при наличии сероводорода чернеет.
3.1.27. Приготовление насыщенного спиртового раствора м е-т иле новой сип и
В 100 см' 96 * этилового спирта растворяют 8 9 г метиленовой сини. Раствор фильтруют.
3.1.28. Приготовление водно-спиртового раствора метиленовой с и II и
К 30 см1 дистиллированной воды лобаатяют I см ' насыщенного спиртового раствора метиленовой сини, приготовленной по п. 3.1.27.
3.1.29. Приготовление метиленовой сини Леффлера
К 100 см* дистиллированной воды лобаатяют 30 см1 насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и I см' I %-ного раствора гидроокиси калия.
3.1.30. Приготовление насыщенного спиртового раствора фуксина
8—9 г основного кристаллического фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см' 96 ' этилового спирта и ставят на 18—24 ч в термостат с температурой 37 С. Флакон периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, и на дне флакона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла. И з насыщенного спиртового раствора готовят водно-спиртовой раствор фуксина. Для этого к 1 см' насыщенного раствора лобаатяют 9 см* дистиллированной воды.
В пробирки кладут мелко нарезанные кусочки печени по 1,5—2 г и заливают смесью печеночного экстракта с мясо-пептонным бульоном. На поверхность среды наслаивают 0.5 — 1 см вазелинового масла. Среду стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 "С.
3.1.23. Разведение пенициллина
На каждые 100 тыс. ед. пенициллина добавляют 1 см1 стерильной дистиллированной воды и получают основное разведение, содержащее 100 тыс. ед. пенициллина в 1 см'. Например, во флакон, содержащий 500 тыс. ел. пенициллина, нужно внести 5 см' дистиллированной воды.
В пять пробирок наливают по 4.5 см' в каждую стерильной дистиллированной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой вносят 0,5 см5 пенициллина основного разведения и получают впервой пробирке разведение, содержащее 10 тыс. ед. пенициллина в I см1 раствора. Новой пипеткой из первой пробирки, тщательно перемешав содержимое, переносят 0.5 см' раствора во вторую пробирку и получают разведение, содержащее 1000 ед. пенициллина в 1 см раствора. Таким же образом из второй пробирки переносят в третью 0.5 см' и получают разведение, содержащее 100 ед. пенициллина в 1 см* раствора. Изтретьей пробирки переносят0.5 см в четвертую и получают разведение, содержащее 10 ед. в I см' раствора. Из четвертой пробирки переносят 0.5 см' в пятую и получают в пятой пробирке разведение, содержащее I ед. пенициллина в I см* раствора.
3.1.24. Приготовление м я с о-п ептонного агара с п е н и ц и л л и н о м
В три колбочки или большие пробирки, содержащие по 20 см-4 стерильного расплавленного и
охлажденного до температуры 45—50'С мясо-пептонного агара (рН 7,2). добавляют в первую колбу I см' пенициллина из четвертой пробирки (см. п. 3.1.23), содержащей в I см' 10 ед. пенициллина, тшательно перемешивают, получают агар, содержащий 0,5 ед. пенициллина в I см', во вторую колбу вносят I см' из пятой пробирки (см. п. 3.1.23), содержащей в 1 см' 1 ед. пенициллина, получают агар, который содержит в 1 см5 0,05 ед. пенициллина; третью колбочку оставляют без пенициллина для контроля. Содержимое всех трех колбочек разливают в стерильные пробирки но 5 см' в каждую и скашивают.
3.1.25. Приготовление индикаторной бумаги для определения индола
5 г парадиметиламидобензальдегида, 10 см1 очищенной концентрированной фосфорной кислоты растворяют в 50 см' 96' спирта. В тепловатом растворе смачивают фильтровальную бумагу, высушивают. нарезают узкими полосками. Цвет бумаги - желтый. При наличии индола цвет бумаги меняется от сиреневато-розового до интенсивно малинового. Появление других цветов на индикаторной бумаге не учитывают.
3.1.26. Приготовление индикаторной бумаги для определения сероводорода
В 100 см' дистиллированной воды растворяют 20 г уксуснокислого свинца и 1 г двууглекислого натрия. Этим раствором пропитывают полоски фильтровальной бумаги, высушивают их при температуре 18—23 "С и нарезают на узкие полоски. После приготовления бумага остается белой: при наличии сероводорода чернеет.
3.1.27. Приготовление насыщенного спиртового раствора м е-т иле новой сип и
В 100 см' 96 * этилового спирта растворяют 8 9 г метиленовой сини. Раствор фильтруют.
3.1.28. Приготовление водно-спиртового раствора метиленовой с и II и
К 30 см1 дистиллированной воды лобаатяют I см ' насыщенного спиртового раствора метиленовой сини, приготовленной по п. 3.1.27.
3.1.29. Приготовление метиленовой сини Леффлера
К 100 см* дистиллированной воды лобаатяют 30 см1 насыщенного спиртового раствора метиленовой сини и I см' I %-ного раствора гидроокиси калия.
3.1.30. Приготовление насыщенного спиртового раствора фуксина
8—9 г основного кристаллического фуксина высыпают во флакон, заливают 100 см' 96 ' этилового спирта и ставят на 18—24 ч в термостат с температурой 37 С. Флакон периодически взбалтывают. В течение указанного времени значительная часть краски растворяется, и на дне флакона остается осадок, свидетельствующий о насыщении раствора.
Насыщенный раствор хранят во флаконах из темного стекла. И з насыщенного спиртового раствора готовят водно-спиртовой раствор фуксина. Для этого к 1 см' насыщенного раствора лобаатяют 9 см* дистиллированной воды.
С. II ГОСТ 21237-75
3.1.31. II р и готовлен и е карболового фуксина и и ля
1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты (фенола) и 0.5 см1 глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 96 " этилового спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см' дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
3.1.32. Приготовление карболового кристаллического фиолетового. генциа н-ф и о л е т о в о г о или метилового фиолетового для окраски по Г рам у
1 г кристалл-, генциан- или метилвиолета растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты (фенола). Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 % " этилового спирта. После того, как краска полностью растворится, прибавляют при постоянном помешивании 100 см5 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Растворы нестойкие.
3.1.33. Приготовление красящей бумаги по Синеву
В 100 см3 96 * этилового спирта растворяют 1 г кристаллвиолета и 1 см3 глицерина. Краску наливают в лоток. Бумагу нарезают полосками шириной 2.0—2,5 см и длиной 30—50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так. чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре 18—23 *С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2-2 см и хранят в банке из темного стекла.
3.1.34. Приготовление раствора Люголя
В 10 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают 5—6 ч до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см' дистиллированной воды. Хранят раствор в склянке из темного стекла.
3.2. Окраска препаратов
3.2.1. Окраска мазков по Г р а м у (общепринятая м о д и ф и к а п и я)
На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый
генпианвиолет. Выдерживают 1 2 мин. после чего снимают бумажку, сливают краску, мазок промывают водой и наливают на него раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают и наливают этиловый спирт на 0.5— I мин. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином или водным раствором сафранина в течение I 2 мин. Затем промывают водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
Окраску по Граму можно применять в водоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генцианвиолета применяют окрашенные полоски фильтровальной бумаги, приготоаленной по п. 3.1.33. Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета. и наносят две-три капли воды, которые полностью впитываются бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.
3.2.2. Окраска капсул методом О л ь т а
Мазки окрашивают 2 %-ны.м водным раствором сафранина в течение 1—3 мин (лучше при подогревании) и быстро смывают водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением: сафранин растворяют в воде, доведенной до кипения и фильтруют через бумажный фильтр.
3.2.3. Окраска капсул методом Ребнгера
Мазки окрашивают и фиксируют одновременно. Готовят раствор: 15—20 г генцианвиолета растворяют в 100 см1 40 %-ного формалина. Раствор остааляют на 8—10 ч при температуре 20 "С. фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированные мазки в течение 15 20 с, быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
3.3. Подготовка образцов к исследованию и проведению посева
3.3.1. Каждый представленный к исследованию образен (мышцы, лимфатические узлы, паренхиматозные органы) перед посевом освобождают от видимой жировой и соединительной ткани, погружают на 2—3 мин в спирт и два раз;) обжигают с поверхности. Затем стерильными ножницами из глубины различных мест каждого образна вырезают кусочки размером не менее 2.0 1.5-2.5 см; лимфатические узлы разрезают пополам. Затем все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами.
3.3.2. Для посева составляют две пробы по 15 г каждая. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, а вторая из кусочков паренхиматозных органов (печени, почки и селезенки).
3.1.31. II р и готовлен и е карболового фуксина и и ля
1 г основного кристаллического фуксина растирают в ступке с 5 г кристаллической карболовой кислоты (фенола) и 0.5 см1 глицерина. Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 96 " этилового спирта. После того, как краска полностью разотрется, прибавляют при постоянном помешивании 100 см' дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют. Фуксин Циля стойкий и его хранят во флаконах из темного стекла с притертой пробкой.
3.1.32. Приготовление карболового кристаллического фиолетового. генциа н-ф и о л е т о в о г о или метилового фиолетового для окраски по Г рам у
1 г кристалл-, генциан- или метилвиолета растирают в ступке с 2 г кристаллической карболовой кислоты (фенола). Во время растирания небольшими порциями прибавляют 10 см3 % " этилового спирта. После того, как краска полностью растворится, прибавляют при постоянном помешивании 100 см5 дистиллированной воды. Раствор краски фильтруют через бумажный фильтр. Растворы нестойкие.
3.1.33. Приготовление красящей бумаги по Синеву
В 100 см3 96 * этилового спирта растворяют 1 г кристаллвиолета и 1 см3 глицерина. Краску наливают в лоток. Бумагу нарезают полосками шириной 2.0—2,5 см и длиной 30—50 см. Полоску погружают на несколько секунд в краску так. чтобы она окрасилась с обеих сторон. Окрашенные полоски вынимают пинцетом, дают краске стечь и подвешивают на шпагате для высушивания. Бумагу сушат на воздухе при комнатной температуре 18—23 *С. Высушенные полоски бумаги разрезают на кусочки размером 2-2 см и хранят в банке из темного стекла.
3.1.34. Приготовление раствора Люголя
В 10 см3 дистиллированной воды растворяют 2 г йодистого калия. Затем прибавляют 1 г кристаллического йода. Раствор выдерживают 5—6 ч до полного растворения йода, после чего прибавляют 290 см' дистиллированной воды. Хранят раствор в склянке из темного стекла.
3.2. Окраска препаратов
3.2.1. Окраска мазков по Г р а м у (общепринятая м о д и ф и к а п и я)
На фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги и наливают карболовый
генпианвиолет. Выдерживают 1 2 мин. после чего снимают бумажку, сливают краску, мазок промывают водой и наливают на него раствор Люголя (мазок чернеет). Через 1—2 мин раствор сливают и наливают этиловый спирт на 0.5— I мин. Затем мазок промывают водой и дополнительно окрашивают водным фуксином или водным раствором сафранина в течение I 2 мин. Затем промывают водой и просушивают мазок фильтровальной бумагой.
Окраску по Граму можно применять в водоизменении Синева, согласно которому вместо карболового генцианвиолета применяют окрашенные полоски фильтровальной бумаги, приготоаленной по п. 3.1.33. Для окрашивания мазков на фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной спиртовым раствором кристаллвиолета. и наносят две-три капли воды, которые полностью впитываются бумагой, последняя плотно прилегает к стеклу. Выдерживают 2 мин, затем бумагу удаляют пинцетом и дальнейшую окраску производят по Граму.
3.2.2. Окраска капсул методом О л ь т а
Мазки окрашивают 2 %-ны.м водным раствором сафранина в течение 1—3 мин (лучше при подогревании) и быстро смывают водой. Раствор сафранина готовят перед употреблением: сафранин растворяют в воде, доведенной до кипения и фильтруют через бумажный фильтр.
3.2.3. Окраска капсул методом Ребнгера
Мазки окрашивают и фиксируют одновременно. Готовят раствор: 15—20 г генцианвиолета растворяют в 100 см1 40 %-ного формалина. Раствор остааляют на 8—10 ч при температуре 20 "С. фильтруют, после чего он готов к употреблению. Окрашивают нефиксированные мазки в течение 15 20 с, быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
3.3. Подготовка образцов к исследованию и проведению посева
3.3.1. Каждый представленный к исследованию образен (мышцы, лимфатические узлы, паренхиматозные органы) перед посевом освобождают от видимой жировой и соединительной ткани, погружают на 2—3 мин в спирт и два раз;) обжигают с поверхности. Затем стерильными ножницами из глубины различных мест каждого образна вырезают кусочки размером не менее 2.0 1.5-2.5 см; лимфатические узлы разрезают пополам. Затем все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами.
3.3.2. Для посева составляют две пробы по 15 г каждая. Одна проба состоит из кусочков мышц и лимфатических узлов, а вторая из кусочков паренхиматозных органов (печени, почки и селезенки).
ГОСТ 21237-75 С. 10
3.3.3. Каждую пробу в отдельности помешают в стерильный стакан (колбу) гомогенизатора для приготовления взвеси. Для этого в стакан (колбу) добавляют по 15 см' физиологического раствора, количество которого равно массе каждой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогенизаторе. Вначале измельчают материал замедленной частотой оборотов, затем с большей частотой оборотов не более 2.5 мин (в зависимости ог числа оборотов).
1 см1 приготоатенной взвеси содержит 0.5 г продукта.
3.3.4. Полученные взвеси отстаивают 10 мин. Из верхней части надосадочной жидкости пипеткой Пастера или петлей вносят на чашку с мясо-пептонным агаром и элективной средой (Эндо. Левина) одну-две капли или одну петлю и тщательно втирают материал в поверхность предварительно подсушенных сред.
3.3.5. Одновременно с посевом на плотные среды производят посев материала для накопления сальмонелл в одну из сред обогащения (селенитовый Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана, Киллиана, хлористомагниевую среду «М»). Для этого 20 см1 взвеси из мыши и лимфатических узлов вносят в один флакон (колбу), а 20 ем1 взвеси из паренхиматозных органов в другой. В каждый флакон наливают по 50 см! среды обогащения.
При отсутствии гомогенизатора допускается посев кусочка пробы размером не менее 2.0 1.5 2,5 см (путем нанесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность питательной среды в чашках с предварительно подсушенным мясо-пептонным агаром и элективной средой Эндо, Левина). При этом необходимо произвести также посев на элективные среды из лимфатического узла печени или соскоба с внутренней стенки желчного пузыря. 11осев в среду обогащения производят во флаконы Сокслета (колбы), в которые предварительно налито по 50 см1 среды обогащения (селенитовой Ф-бульон. Мюллера, Кауфмана. Киллиана. хлористомагниевая среда «М»). В один флакон вносится измельченная проба из мышц и лимфатических узлов массой 10 г, а в другой — 10 г из паренхиматозных органов.
Следует иметь в виду, что на селенитовом Ф-бульоне S. typhi suis и S. cholerae suis, как правило, не растут. Наилучший рост S. cholerae suis наблюдается на среде Киллиана.
3.3.6. Посевы помешают в термостат при температуре 37 "С. Через IX ч чашки с первичными посевами на плотных средах изатекают из термостата и просматривают визуально, при необходимости
через лупу или под малым увеличением микроскопа.
11ри отсутствии роста через 1S ч посевы выдерживают в термостате дополнительно до 24 ч.
На мясо-пептоппом агаре отыскивают колонии, характерные для сибирской язвы. рожи, пасте-реллеза. лнстерноза. кокковых инфекций и др.
На чашках с элективными средами (Эндо, Левина) отыскивают колонии, характерные для бактерий семейства кишечных.
При обнаружении в мазках микробов, подозрительных на сибирскую язву, посевы на элективную среду и среду обогащения не производят.
4. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Бак к-риос коническое исследование
Из паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки) лимфатических узлов туши или из пораженных участков органа и ткани приготоатяют 2—10 мазков-отпечатков (в зависимости от характера патологических изменений и предполагаемого диагноза).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают одновременно и по Граму и 2 %-ным раствором сафранина или раствором Ребнгера.
При бактериоскопии мазков прежде всего обращают внимание на наличие возбудителя сибирской язвы.
При окраске сафранином сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы, тени (следы распада бактерий) в светло-желтый.
При окраске раствором Ребнгера сибиреязвенные бациллы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы в красно-фиолетовый.
В мазках из лимфатических узлов или других тканей свиней, крупного рогатого скота при очаговом поражении, наряду с типичными капсульными палочками, могут обнаруживаться атипичные бациллы сибирской язвы в виде сильно изогнутых или перекрученных длинных нитей, разбухших и потерявших правильные контуры, или распавшихся на отдельные, как бы осколки бацилл или теней различной величины, отрицательно окрашивающихся по Граму или в виде конгломерата капсул, наполненных мельчайшими включениями.
14-2264
3.3.3. Каждую пробу в отдельности помешают в стерильный стакан (колбу) гомогенизатора для приготовления взвеси. Для этого в стакан (колбу) добавляют по 15 см' физиологического раствора, количество которого равно массе каждой пробы, и гомогенизируют пробы в электрическом гомогенизаторе. Вначале измельчают материал замедленной частотой оборотов, затем с большей частотой оборотов не более 2.5 мин (в зависимости ог числа оборотов).
1 см1 приготоатенной взвеси содержит 0.5 г продукта.
3.3.4. Полученные взвеси отстаивают 10 мин. Из верхней части надосадочной жидкости пипеткой Пастера или петлей вносят на чашку с мясо-пептонным агаром и элективной средой (Эндо. Левина) одну-две капли или одну петлю и тщательно втирают материал в поверхность предварительно подсушенных сред.
3.3.5. Одновременно с посевом на плотные среды производят посев материала для накопления сальмонелл в одну из сред обогащения (селенитовый Ф-бульон, Мюллера, Кауфмана, Киллиана, хлористомагниевую среду «М»). Для этого 20 см1 взвеси из мыши и лимфатических узлов вносят в один флакон (колбу), а 20 ем1 взвеси из паренхиматозных органов в другой. В каждый флакон наливают по 50 см! среды обогащения.
При отсутствии гомогенизатора допускается посев кусочка пробы размером не менее 2.0 1.5 2,5 см (путем нанесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность питательной среды в чашках с предварительно подсушенным мясо-пептонным агаром и элективной средой Эндо, Левина). При этом необходимо произвести также посев на элективные среды из лимфатического узла печени или соскоба с внутренней стенки желчного пузыря. 11осев в среду обогащения производят во флаконы Сокслета (колбы), в которые предварительно налито по 50 см1 среды обогащения (селенитовой Ф-бульон. Мюллера, Кауфмана. Киллиана. хлористомагниевая среда «М»). В один флакон вносится измельченная проба из мышц и лимфатических узлов массой 10 г, а в другой — 10 г из паренхиматозных органов.
Следует иметь в виду, что на селенитовом Ф-бульоне S. typhi suis и S. cholerae suis, как правило, не растут. Наилучший рост S. cholerae suis наблюдается на среде Киллиана.
3.3.6. Посевы помешают в термостат при температуре 37 "С. Через IX ч чашки с первичными посевами на плотных средах изатекают из термостата и просматривают визуально, при необходимости
через лупу или под малым увеличением микроскопа.
11ри отсутствии роста через 1S ч посевы выдерживают в термостате дополнительно до 24 ч.
На мясо-пептоппом агаре отыскивают колонии, характерные для сибирской язвы. рожи, пасте-реллеза. лнстерноза. кокковых инфекций и др.
На чашках с элективными средами (Эндо, Левина) отыскивают колонии, характерные для бактерий семейства кишечных.
При обнаружении в мазках микробов, подозрительных на сибирскую язву, посевы на элективную среду и среду обогащения не производят.
4. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Бак к-риос коническое исследование
Из паренхиматозных органов (печени, почек, селезенки) лимфатических узлов туши или из пораженных участков органа и ткани приготоатяют 2—10 мазков-отпечатков (в зависимости от характера патологических изменений и предполагаемого диагноза).
Препараты высушивают на воздухе, фиксируют и окрашивают одновременно и по Граму и 2 %-ным раствором сафранина или раствором Ребнгера.
При бактериоскопии мазков прежде всего обращают внимание на наличие возбудителя сибирской язвы.
При окраске сафранином сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы, тени (следы распада бактерий) в светло-желтый.
При окраске раствором Ребнгера сибиреязвенные бациллы окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а капсулы в красно-фиолетовый.
В мазках из лимфатических узлов или других тканей свиней, крупного рогатого скота при очаговом поражении, наряду с типичными капсульными палочками, могут обнаруживаться атипичные бациллы сибирской язвы в виде сильно изогнутых или перекрученных длинных нитей, разбухших и потерявших правильные контуры, или распавшихся на отдельные, как бы осколки бацилл или теней различной величины, отрицательно окрашивающихся по Граму или в виде конгломерата капсул, наполненных мельчайшими включениями.
14-2264
С. II ГОСТ 21237-75
Наличие в мазках грамположительных палочек с обрубленными концами, а при окраске сафранином или раствором Регибера — палочек или цепочек с капсулами или теней в мазках из лимфатических узлов свиней со специфической для сибирской язвы патологической картиной, дает предварительное заключение об обнаружении (бактерноекопически) микробов, характерных для возбудителя сибирской язвы.
При наличии в мазках атипичных бацилл одновременно с бактериоскопией ставят реакцию преципитации.
В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на питательных средах проводят исследования на наличие определенных микробов.
4.2. Методы выявления аэробных бактерий
4.2.1. В ы я в л е н и е бацилл сибирской язв ы
4.2.1.1 Сущность метода выявления бацилл сибирской язвы заключается в определении их характерной морфологии, в определении характера роста на питательных средах и выявлении патогенности путем заражения лабораторных животных.
4.2.1.2. Проведение исследования
Бацилл сибирской язвы обнаруживают в три последовательных этапа: бактериоскопия мазков из патологического материала: получение и изучение свойств чистой культуры на питательных средах: биологическая проба на лабораторных животных и, при необходимости, серологическое исследование.
При бактериоскопии мазков из патологического материала обращают внимание на форму и расположение отдельных микробов и наличие капсул. Характерный вид сибиреязвенных палочек и обилие их в мазке нередко позволяет поставить диагноз уже по результатам бактериоскопического исследования.
Бациллы сибирской язвы на чашках с мясо-пептонным агаром через 16- 24 ч растут в виде серо-белых шероховатых с бахромчатыми краями колоний, напоминающих под лупой или при малом увеличении микроскопа «головку медузы», «львиную гриву». Из подозрительной колонии делают посев в пробирку с мясо-пептонным бульоном.
На мясо-пептонном бульоне сибиреязвенные бациллы растут в виде крупных хлопьев, оседающих на дно пробирки к концу первых суток, с образованием осадка, напоминающего комок ваты, бульон остается прозрачным.
Из бульонной культуры готовят препарат «раздавленная» или «висячая капля». При микроскопн-ровапин препарата обнаруживаются неподвижные сибиреязвенные палочки.
При необходимости дифференциации сибиреязвенных бацилл от сапрофитных бацилл, которые морфологически очень сходны, выделенную чистую культуру на мясо-пептонном агаре или мясо-пептонном бульоне исследуют: на тест «жемчужное ожерелье», чувствительность к сибиреязвенному фагу, свертываемость желтка куриного яйца, гемолитическую активность, капсулообразование.
Гест «жемчужное ожерелье» осущестатяют одним из двух способов:
Первый способ. Постановку теста начинают с разведения пенициллина по п. 3.1.23. В три пробирки с мясо-пептоиным агаром, в каждой из которых содержится по 0,5 и 0,05 ед. пенициллина в 1 см5 (по п. 3.1.24). и в контрольную пробирку без пенициллина вносят по 0,25 см' трехчасовых бульонных культур испытуемых штаммов, выращенных в термостате при температуре 37 'С. Посевы помешают в термостат в наклонном положении (на деревянную рейку или стеклянную трубку) при температуре 37 'С. Через 3 ч из конденсационной жидкости беруг бактериологической петлей материал и готовят на предметных стеклах мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в течение 15 мин спирто-эфирной смесью и окрашивают метилеповой синыо. разведенным фуксином или по Граму.
Второй способ. К мясо-пептонному бульону (рН 7.2—7.4) стерильно добааляюг 20 % сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта. Для этого берут три пробирки, в каждой из которых содержится по N см' мясо-пептонного бульона, и добаатяют в каждую пробирку 2,0 см* сыворотки крови крупного рогатого скота. В первую пробирку добавляют 0.5 см5 пенициллина, содержащего 10 ед. в I см' раствора, получают бульон, содержащий в I см 0.5 ед. пенициллина; во вторую пробирку добавляют 0.5 см1 пенициллина из пробирки, содержащей I ед. пенициллина в I см' раствора; в третью пробирку пенициллина не добаатяют. в ней остается мясо-пептонный бульон с сывороткой крови (контрольная). Бульон с сывороткой крови и пенициллином рахливают в стерильные пробирки по 2.5 см' и вносят в каждую из них по 0.25 см' трехчасовой бульонной культуры, выращенной в термостате при температуре 37 *С, испытуемых штаммов. Для контроля производят посев в бульон с сывороткой крови без пенициллина.
Мясо-пептонный бульон перед посевом нагревают на водяной бане до температуры 40 *С, и засеянные пробирки выдерживают в термостате при температуре 37 "С в течение 3—6 ч.
Наличие в мазках грамположительных палочек с обрубленными концами, а при окраске сафранином или раствором Регибера — палочек или цепочек с капсулами или теней в мазках из лимфатических узлов свиней со специфической для сибирской язвы патологической картиной, дает предварительное заключение об обнаружении (бактерноекопически) микробов, характерных для возбудителя сибирской язвы.
При наличии в мазках атипичных бацилл одновременно с бактериоскопией ставят реакцию преципитации.
В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на питательных средах проводят исследования на наличие определенных микробов.
4.2. Методы выявления аэробных бактерий
4.2.1. В ы я в л е н и е бацилл сибирской язв ы
4.2.1.1 Сущность метода выявления бацилл сибирской язвы заключается в определении их характерной морфологии, в определении характера роста на питательных средах и выявлении патогенности путем заражения лабораторных животных.
4.2.1.2. Проведение исследования
Бацилл сибирской язвы обнаруживают в три последовательных этапа: бактериоскопия мазков из патологического материала: получение и изучение свойств чистой культуры на питательных средах: биологическая проба на лабораторных животных и, при необходимости, серологическое исследование.
При бактериоскопии мазков из патологического материала обращают внимание на форму и расположение отдельных микробов и наличие капсул. Характерный вид сибиреязвенных палочек и обилие их в мазке нередко позволяет поставить диагноз уже по результатам бактериоскопического исследования.
Бациллы сибирской язвы на чашках с мясо-пептонным агаром через 16- 24 ч растут в виде серо-белых шероховатых с бахромчатыми краями колоний, напоминающих под лупой или при малом увеличении микроскопа «головку медузы», «львиную гриву». Из подозрительной колонии делают посев в пробирку с мясо-пептонным бульоном.
На мясо-пептонном бульоне сибиреязвенные бациллы растут в виде крупных хлопьев, оседающих на дно пробирки к концу первых суток, с образованием осадка, напоминающего комок ваты, бульон остается прозрачным.
Из бульонной культуры готовят препарат «раздавленная» или «висячая капля». При микроскопн-ровапин препарата обнаруживаются неподвижные сибиреязвенные палочки.
При необходимости дифференциации сибиреязвенных бацилл от сапрофитных бацилл, которые морфологически очень сходны, выделенную чистую культуру на мясо-пептонном агаре или мясо-пептонном бульоне исследуют: на тест «жемчужное ожерелье», чувствительность к сибиреязвенному фагу, свертываемость желтка куриного яйца, гемолитическую активность, капсулообразование.
Гест «жемчужное ожерелье» осущестатяют одним из двух способов:
Первый способ. Постановку теста начинают с разведения пенициллина по п. 3.1.23. В три пробирки с мясо-пептоиным агаром, в каждой из которых содержится по 0,5 и 0,05 ед. пенициллина в 1 см5 (по п. 3.1.24). и в контрольную пробирку без пенициллина вносят по 0,25 см' трехчасовых бульонных культур испытуемых штаммов, выращенных в термостате при температуре 37 'С. Посевы помешают в термостат в наклонном положении (на деревянную рейку или стеклянную трубку) при температуре 37 'С. Через 3 ч из конденсационной жидкости беруг бактериологической петлей материал и готовят на предметных стеклах мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в течение 15 мин спирто-эфирной смесью и окрашивают метилеповой синыо. разведенным фуксином или по Граму.
Второй способ. К мясо-пептонному бульону (рН 7.2—7.4) стерильно добааляюг 20 % сыворотки крови крупного рогатого скота без консерванта. Для этого берут три пробирки, в каждой из которых содержится по N см' мясо-пептонного бульона, и добаатяют в каждую пробирку 2,0 см* сыворотки крови крупного рогатого скота. В первую пробирку добавляют 0.5 см5 пенициллина, содержащего 10 ед. в I см' раствора, получают бульон, содержащий в I см 0.5 ед. пенициллина; во вторую пробирку добавляют 0.5 см1 пенициллина из пробирки, содержащей I ед. пенициллина в I см' раствора; в третью пробирку пенициллина не добаатяют. в ней остается мясо-пептонный бульон с сывороткой крови (контрольная). Бульон с сывороткой крови и пенициллином рахливают в стерильные пробирки по 2.5 см' и вносят в каждую из них по 0.25 см' трехчасовой бульонной культуры, выращенной в термостате при температуре 37 *С, испытуемых штаммов. Для контроля производят посев в бульон с сывороткой крови без пенициллина.
Мясо-пептонный бульон перед посевом нагревают на водяной бане до температуры 40 *С, и засеянные пробирки выдерживают в термостате при температуре 37 "С в течение 3—6 ч.
ГОСТ 21237-75 С. 12
Дальнейший ход исследования проводят в той же последовательности, которая изложена в первом способе.
В случаях отрицательных результатов микроскопии через 3 ч инкубации посевов (на мясо-пептон-ном агаре и мясо-пептонном бульоне) следует продолжить инкубацию до 6 ч и после этого провести заключительный учет теста.
При положительной реакции теста «жемчужное ожерелье» бациллы сибирской язвы образуют цепочки шарообразной формы, которые приобретают сходство с ожерельем из бус. Споровые сапрофитные аэробные бактерии, как правило, не образуют шарообразных форм, а имеют обычную форму палочек, т. е. дают отрицательный результат при постановке этого теста.
Лизис с и б и р е я з в е п и ы м ф а г о м «Г а м м а М В Л» осуществляют одним из двух способов:
Первый способ. Па поверхности пластинки с мясо-пептонным агаром (рН 7.2 — 7.4) в чашке Петри стерильной пробиркой с ровными краями делают 5—6 насечек. Бактериологической петлей или стерильной пастеровской пипеткой с тонко оттянутым концом на поверхность агара в центр насечки (кружка) наносят одну каплю трехчасовой бульонной культуры испытуемых штаммов. Внесенную каплю распределяют равномерно петлей по всей поверхности насечки. Засеянные чашки подсушивают в течение 15 20 мин при температуре 37 "С. после чего в центр каждого посева наносят каплю не разве денного фага, вновь подсушивают в течение И) мин при температуре 37 "С, и затем чашки помешают в термостат при температуре 37 "С.
Через 6 S ч в месте посева можно обнаружить стерильное пятно, в контрольных чашках все насечки покрыты культурой, как и в чашках, в которых испытывалиеь сапрофитные спорообразую-шне аэробные бактерии.
Второй способ - способ «стекающей капли». Исследуемую культуру высевают в три пробирки на скошенный мясо-пептонный агар и выдерживают в термостате при температуре 37 С не более 20 мин. Пробирки ставят вертикально в штатив. Затем на верхнюю часть агара наносят каплю неразведенного бактериофага. Одну пробирку оставляют для контроля без фага. Действие фага устанавливают через 6— 8 ч. В контрольной пробирке по всей поверхности агара наблюдается обычный рост культуры. В пробирках с фагом по ходу стекания капли микробы не растут, а вокруг этой зоны наблюдается обычный рост культуры в виде «бордюра».
Наиболее четко яаленне лизиса наблюдается через 16—18 ч.
Свертываемость желтка куриного яйиа определяют следующим образом.
Испытуемую культуру высевают в пробирку со средой Дрожжевкиной, приготовленной по п. 3.1.21. Посевы помешают в термостат при температуре 37 "С на время от 8 до 24 ч. За указанное время сибиреязвенная палочка не вызывает коагуляцию желтка куриного яйца, а большинство спорообразу-юших аэробных бактерий коагулируют желток угже через 6 8 ч.
Гемолитическую акт ивность определяют следующим образом.
Испытываемую культуру высевают на чашку с мясо-пептонным агаром с кровью или в пробирку бульона с кровью. Чашку или пробирку помешают в термостат при температуре 37 "С на 20—24 ч.
При наличии бапилл сибирской язвы на чашке вырастают характерные колонии без гемолиза, бульон с кровью также не гемолизируется. При наличии других сапрофитных спорообразующих бацилл, в большинстве случаев, вокруг колоний образуется зона (J-гемолиза и наступает гемолиз бульона с кровью.
Определение к а п с у л о о б р а з о в а н и я in vitro.
Испытуемую культуру петлей высевают в пробирку со средой «ГКИ». приготовленной по п. 3.1.20, пробирку помещают в термостат при температуре 37 'С. Через 30—120 мин у отдельных сибиреязвенных палочек начинается капсулообразование. а через 16—18 ч все или большинство сибиреязвенных бацилл образуют капсулу. Со среды готовят мазки, фиксиру ют их 15 мин в метаноле и окрашивают синью Леффлера в течение 15 мин. При микроскопии обнаруживают синие палочки и нити, окруженные розовой капсулой.
Одновременно с бактериоскопией исходного материала в сомнительных случаях производят реакцию преципитации.
Постановка реакции преципитации
2 г материала мелко нарезают в пробирку и заливают 10 см' карболизированного 0,5 %-ного физиологического раствора. Если исследуют свежий материал, то его предварительно выдерживают в термостате в течение 18 24 ч при температуре 37 'С. Затем экстракт кипятят в течение 30 40 мин и фильтруют через асбестовую нейтральную вату до полной про1рачности. 0,25 0.3 см' прозрачного экстракта вносят в узкую пробирку и под него подслаивают такое же количество преципитируюшей сибиреязвенной сыворотки, профильтрованной через бумажный фильтр.
Дальнейший ход исследования проводят в той же последовательности, которая изложена в первом способе.
В случаях отрицательных результатов микроскопии через 3 ч инкубации посевов (на мясо-пептон-ном агаре и мясо-пептонном бульоне) следует продолжить инкубацию до 6 ч и после этого провести заключительный учет теста.
При положительной реакции теста «жемчужное ожерелье» бациллы сибирской язвы образуют цепочки шарообразной формы, которые приобретают сходство с ожерельем из бус. Споровые сапрофитные аэробные бактерии, как правило, не образуют шарообразных форм, а имеют обычную форму палочек, т. е. дают отрицательный результат при постановке этого теста.
Лизис с и б и р е я з в е п и ы м ф а г о м «Г а м м а М В Л» осуществляют одним из двух способов:
Первый способ. Па поверхности пластинки с мясо-пептонным агаром (рН 7.2 — 7.4) в чашке Петри стерильной пробиркой с ровными краями делают 5—6 насечек. Бактериологической петлей или стерильной пастеровской пипеткой с тонко оттянутым концом на поверхность агара в центр насечки (кружка) наносят одну каплю трехчасовой бульонной культуры испытуемых штаммов. Внесенную каплю распределяют равномерно петлей по всей поверхности насечки. Засеянные чашки подсушивают в течение 15 20 мин при температуре 37 "С. после чего в центр каждого посева наносят каплю не разве денного фага, вновь подсушивают в течение И) мин при температуре 37 "С, и затем чашки помешают в термостат при температуре 37 "С.
Через 6 S ч в месте посева можно обнаружить стерильное пятно, в контрольных чашках все насечки покрыты культурой, как и в чашках, в которых испытывалиеь сапрофитные спорообразую-шне аэробные бактерии.
Второй способ - способ «стекающей капли». Исследуемую культуру высевают в три пробирки на скошенный мясо-пептонный агар и выдерживают в термостате при температуре 37 С не более 20 мин. Пробирки ставят вертикально в штатив. Затем на верхнюю часть агара наносят каплю неразведенного бактериофага. Одну пробирку оставляют для контроля без фага. Действие фага устанавливают через 6— 8 ч. В контрольной пробирке по всей поверхности агара наблюдается обычный рост культуры. В пробирках с фагом по ходу стекания капли микробы не растут, а вокруг этой зоны наблюдается обычный рост культуры в виде «бордюра».
Наиболее четко яаленне лизиса наблюдается через 16—18 ч.
Свертываемость желтка куриного яйиа определяют следующим образом.
Испытуемую культуру высевают в пробирку со средой Дрожжевкиной, приготовленной по п. 3.1.21. Посевы помешают в термостат при температуре 37 "С на время от 8 до 24 ч. За указанное время сибиреязвенная палочка не вызывает коагуляцию желтка куриного яйца, а большинство спорообразу-юших аэробных бактерий коагулируют желток угже через 6 8 ч.
Гемолитическую акт ивность определяют следующим образом.
Испытываемую культуру высевают на чашку с мясо-пептонным агаром с кровью или в пробирку бульона с кровью. Чашку или пробирку помешают в термостат при температуре 37 "С на 20—24 ч.
При наличии бапилл сибирской язвы на чашке вырастают характерные колонии без гемолиза, бульон с кровью также не гемолизируется. При наличии других сапрофитных спорообразующих бацилл, в большинстве случаев, вокруг колоний образуется зона (J-гемолиза и наступает гемолиз бульона с кровью.
Определение к а п с у л о о б р а з о в а н и я in vitro.
Испытуемую культуру петлей высевают в пробирку со средой «ГКИ». приготовленной по п. 3.1.20, пробирку помещают в термостат при температуре 37 'С. Через 30—120 мин у отдельных сибиреязвенных палочек начинается капсулообразование. а через 16—18 ч все или большинство сибиреязвенных бацилл образуют капсулу. Со среды готовят мазки, фиксиру ют их 15 мин в метаноле и окрашивают синью Леффлера в течение 15 мин. При микроскопии обнаруживают синие палочки и нити, окруженные розовой капсулой.
Одновременно с бактериоскопией исходного материала в сомнительных случаях производят реакцию преципитации.
Постановка реакции преципитации
2 г материала мелко нарезают в пробирку и заливают 10 см' карболизированного 0,5 %-ного физиологического раствора. Если исследуют свежий материал, то его предварительно выдерживают в термостате в течение 18 24 ч при температуре 37 'С. Затем экстракт кипятят в течение 30 40 мин и фильтруют через асбестовую нейтральную вату до полной про1рачности. 0,25 0.3 см' прозрачного экстракта вносят в узкую пробирку и под него подслаивают такое же количество преципитируюшей сибиреязвенной сыворотки, профильтрованной через бумажный фильтр.
С. II ГОСТ 21237-75
Реакция считается положительной, если на границе сыворотки и экстракта через 3—8 мин появляется пренипитируюшее кольцо; сомнительной, если оно появляется через 10—15 мин и отрицательной — при отсутствии кольца.
При проведении реакции преципитации контролем служат: заведомо сибиреязвенный антиген с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой, нормальная сыворотка с исследуемым экстрактом и преципитирующая сыворотка с физиологическим раствором.
При первом контроле должно получиться белое кольцо, а при втором и третьем кольцо отсутствует.
Постановка биологической пробы
Ятя постановки биологической пробы на животных часть исходного материала растирают в ступке со стерильным песком и небольших« количеством физиологического раствора. 0.5 см* взвеси впрыскивают двум белым мышам под кожу в области спины.
При исследовании материала от свиней (подчелюстные лимфатические узлы) опытных животных заражают только полученной чистой культурой.
В случае гибели мышей, что обычно наблюдается через 24 72 ч. их вскрывают: из крови сердца, печени, селезенки и места заражения приготовляют мазки, а из органов делают посевы.
В материале из свиней на мясо-пептонном агаре колонии сибиреязвенных бацилл могут быть атипичными, ослабленной вирулентности или невирулентными, но обладающими всеми другими характерными признаками сибиреязвенных возбудителей.
4.2.1.3. Обработка результатов
Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву яаляются: наличие в мазках из патологического материала капсулообразуюших палочек, а из колоний грамположительных неподвижных бацилл; характерный рост на питательных средах; положительная реакция преципитации и положительный результат биологической пробы.
4.2.2 Выявление бактерий рожи сии ней. л и с т е р и о з а и пасте-р е л л е з а
4.2.2.1. Сущность метода выявления бактерий рожи свиней, листериоза и пастереллеза заключается в определении специфического роста этих микроорганизмов на мясо-пептонном агаре и их дифференциации по морфологическим, культурным и биологическим свойствам.
4.2.2.2. Проведение исследования
Наличие роста на чашках с мясо-пептонным агаром мелких прозрачных колоний требует проведения исследований на присутствие бактерий рожи свиней, листериоза и пастереллеза. Из подозрительных колоний приготовляют мазки с окраской по Граму, исследуют на подвижность и производят посев на мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон.
Дифференциальный диагноз рожи свиней и листериоза проводят в соответствии с показателями, указанны ми в табл. 1.
Таблица 1
Иаимсмопаинс показателя Характерисшка бактерий
рожи спннсй лнегериоха
Мазки-отпечатки Рост на мясо-пептонном агаре Рост на мясо-пептонном бульоне Мазки из культуры Несиорообразуюшие. тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки, иногда нити .Мелкие росинчатые. прозрачные колонии Легкое помутнение, поднимающийся при встряхивании осадок Короткие, прямые или слегка изогнутые палочки; при хроническом течении инфекции — как короткие тонкие палочки, так и удлиненные цепочки и ниги Неспорообразующие, короткие палочки с закругленными концами. Располагаются поодиночке, попарно, в <)юрме римской нифры V или в виде палисада Мелкие росинчатые, прозрачные колонии. Через 2—3 суток наблюдается помутнение колоний Небольшое помутнение с образованием слизистого осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички Короткие, прямые, овоидные палочки. иногда почти кокки, располагаются поодиночке или кучками
Реакция считается положительной, если на границе сыворотки и экстракта через 3—8 мин появляется пренипитируюшее кольцо; сомнительной, если оно появляется через 10—15 мин и отрицательной — при отсутствии кольца.
При проведении реакции преципитации контролем служат: заведомо сибиреязвенный антиген с сибиреязвенной преципитирующей сывороткой, нормальная сыворотка с исследуемым экстрактом и преципитирующая сыворотка с физиологическим раствором.
При первом контроле должно получиться белое кольцо, а при втором и третьем кольцо отсутствует.
Постановка биологической пробы
Ятя постановки биологической пробы на животных часть исходного материала растирают в ступке со стерильным песком и небольших« количеством физиологического раствора. 0.5 см* взвеси впрыскивают двум белым мышам под кожу в области спины.
При исследовании материала от свиней (подчелюстные лимфатические узлы) опытных животных заражают только полученной чистой культурой.
В случае гибели мышей, что обычно наблюдается через 24 72 ч. их вскрывают: из крови сердца, печени, селезенки и места заражения приготовляют мазки, а из органов делают посевы.
В материале из свиней на мясо-пептонном агаре колонии сибиреязвенных бацилл могут быть атипичными, ослабленной вирулентности или невирулентными, но обладающими всеми другими характерными признаками сибиреязвенных возбудителей.
4.2.1.3. Обработка результатов
Основанием для постановки диагноза на сибирскую язву яаляются: наличие в мазках из патологического материала капсулообразуюших палочек, а из колоний грамположительных неподвижных бацилл; характерный рост на питательных средах; положительная реакция преципитации и положительный результат биологической пробы.
4.2.2 Выявление бактерий рожи сии ней. л и с т е р и о з а и пасте-р е л л е з а
4.2.2.1. Сущность метода выявления бактерий рожи свиней, листериоза и пастереллеза заключается в определении специфического роста этих микроорганизмов на мясо-пептонном агаре и их дифференциации по морфологическим, культурным и биологическим свойствам.
4.2.2.2. Проведение исследования
Наличие роста на чашках с мясо-пептонным агаром мелких прозрачных колоний требует проведения исследований на присутствие бактерий рожи свиней, листериоза и пастереллеза. Из подозрительных колоний приготовляют мазки с окраской по Граму, исследуют на подвижность и производят посев на мясо-пептонный агар и мясо-пептонный бульон.
Дифференциальный диагноз рожи свиней и листериоза проводят в соответствии с показателями, указанны ми в табл. 1.
Таблица 1
Иаимсмопаинс показателя Характерисшка бактерий
рожи спннсй лнегериоха
Мазки-отпечатки Рост на мясо-пептонном агаре Рост на мясо-пептонном бульоне Мазки из культуры Несиорообразуюшие. тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки, иногда нити .Мелкие росинчатые. прозрачные колонии Легкое помутнение, поднимающийся при встряхивании осадок Короткие, прямые или слегка изогнутые палочки; при хроническом течении инфекции — как короткие тонкие палочки, так и удлиненные цепочки и ниги Неспорообразующие, короткие палочки с закругленными концами. Располагаются поодиночке, попарно, в <)юрме римской нифры V или в виде палисада Мелкие росинчатые, прозрачные колонии. Через 2—3 суток наблюдается помутнение колоний Небольшое помутнение с образованием слизистого осадка, поднимающегося при встряхивании в виде косички Короткие, прямые, овоидные палочки. иногда почти кокки, располагаются поодиночке или кучками
ГОСТ 21237-75 С. 14
Продолжение
Наименование Характеристики бактерий
показателя рожи свиней л нетерпим
Окраска по Гриму Положительная Положительная
Подвижность Неподвижен Подвижен н молодой 6—20 ч культуре. выращенной при температуре 20—22 'С
Проба на каталазу Отрицательная Положительная
Для проведения пробы на каталазу к суточной культуре добавляют I см5 10 %-ного раствора перекиси водорода.
Бактерии листерноза, выделяя каталазу. разлагают перекись водорода с образованием пузырьков
газа.
При необходимости дополнительной дифференциации бактерий листерноза от бактерий рожи свиней применяют посевы: на желатин, на углеводную среду с салицином, на мясо-пептонный печеночный агар с 0.01 % теялурита калия, на мясо-пептонный агар с кровью, а также ставят коныонкти-валысую пробу на морских свинках.
Бактерии листерноза. в отличие от бактерий рожи свиней, на желатине дают медленный рост в виде узловатой нити с неровными краями и пушистыми отростками, желатин не разжижают, ферментируют салиннн. вызывают ^-гемолиз на агаре с кровью, растут на мясо-пептонном печеночном агаре с 0,5 % глюкозы, 3 % глицерина и 0.01 % теллурита калия в виде мелких черных колоний и вызывают кератоконыонктнвит у морских свинок.
Бактерии пастереллезов, выделенные из туш и из паренхиматозных органов, предстапляют собой единый род бактерий с одинаковыми морфологическими культу рал ьны ми и ферментативными свойствами, но различающихся по вирулентным свойствам.
Дифференциальный диагноз пастереллеза проводят в соответствии с показателями, указанными в табл. 2.
Таблица 2
Наименование показателя Характеристика бактерий гысте реллеш
Мазки-отпечатки из материала Неспорообразуюшие. мелкие, биполярно окра-
шивающиеся палочки
Окраска по Граму Отрицательная
Рост на мясо-пептонном агаре Мелкие, росинчатые. слегка опалссцирующис
профачные колонии, которые принимают через 2—3
суток серовато-белый пвет
Рост на мясо-исптонном бульоне Равномерное помутнение с осадком
Мазки из культур Ьиполярнооь почти всегда отсутствует
Подвижность Неподвижны
4.2.2.3. Обработка релу.шпатов
О наличии бактерий судят в соответствии с характеристиками табл. I и 2.
4.2.3. Выявление бактерий кокковой группы
4.2.3.1. Сущность метода выявления бактерий кокковой группы (стафилококков, стрептококков) заключается в определении морфологии, определении характера роста на питательных средах и способности отдельных стафилококков коагулировать нитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
4.2.3.2. Провение исследований
Наличие на чашках с мясо-пептонным агаром мелких прозрачных или мутноватых колоний, иногда образующих различные пигменты, вызывает подозрение на присутствие возбудителей кокковых инфекций (диплококкоза, стафилококкоза, сгрептококкоза).
Дифференциальный диагноз ставят на основании микроскопического исследования (грамиоло-жительные. неподвижные, неспорообразуюшие, круглые клетки, располагающиеся одиночно)
Продолжение
Наименование Характеристики бактерий
показателя рожи свиней л нетерпим
Окраска по Гриму Положительная Положительная
Подвижность Неподвижен Подвижен н молодой 6—20 ч культуре. выращенной при температуре 20—22 'С
Проба на каталазу Отрицательная Положительная
Для проведения пробы на каталазу к суточной культуре добавляют I см5 10 %-ного раствора перекиси водорода.
Бактерии листерноза, выделяя каталазу. разлагают перекись водорода с образованием пузырьков
газа.
При необходимости дополнительной дифференциации бактерий листерноза от бактерий рожи свиней применяют посевы: на желатин, на углеводную среду с салицином, на мясо-пептонный печеночный агар с 0.01 % теялурита калия, на мясо-пептонный агар с кровью, а также ставят коныонкти-валысую пробу на морских свинках.
Бактерии листерноза. в отличие от бактерий рожи свиней, на желатине дают медленный рост в виде узловатой нити с неровными краями и пушистыми отростками, желатин не разжижают, ферментируют салиннн. вызывают ^-гемолиз на агаре с кровью, растут на мясо-пептонном печеночном агаре с 0,5 % глюкозы, 3 % глицерина и 0.01 % теллурита калия в виде мелких черных колоний и вызывают кератоконыонктнвит у морских свинок.
Бактерии пастереллезов, выделенные из туш и из паренхиматозных органов, предстапляют собой единый род бактерий с одинаковыми морфологическими культу рал ьны ми и ферментативными свойствами, но различающихся по вирулентным свойствам.
Дифференциальный диагноз пастереллеза проводят в соответствии с показателями, указанными в табл. 2.
Таблица 2
Наименование показателя Характеристика бактерий гысте реллеш
Мазки-отпечатки из материала Неспорообразуюшие. мелкие, биполярно окра-
шивающиеся палочки
Окраска по Граму Отрицательная
Рост на мясо-пептонном агаре Мелкие, росинчатые. слегка опалссцирующис
профачные колонии, которые принимают через 2—3
суток серовато-белый пвет
Рост на мясо-исптонном бульоне Равномерное помутнение с осадком
Мазки из культур Ьиполярнооь почти всегда отсутствует
Подвижность Неподвижны
4.2.2.3. Обработка релу.шпатов
О наличии бактерий судят в соответствии с характеристиками табл. I и 2.
4.2.3. Выявление бактерий кокковой группы
4.2.3.1. Сущность метода выявления бактерий кокковой группы (стафилококков, стрептококков) заключается в определении морфологии, определении характера роста на питательных средах и способности отдельных стафилококков коагулировать нитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
4.2.3.2. Провение исследований
Наличие на чашках с мясо-пептонным агаром мелких прозрачных или мутноватых колоний, иногда образующих различные пигменты, вызывает подозрение на присутствие возбудителей кокковых инфекций (диплококкоза, стафилококкоза, сгрептококкоза).
Дифференциальный диагноз ставят на основании микроскопического исследования (грамиоло-жительные. неподвижные, неспорообразуюшие, круглые клетки, располагающиеся одиночно)
С. II ГОСТ 21237-75
почками, гроздями и в виде ланцетовидных диплококков), а также определения характера роста на питательных средах.
На мясо-пептонном бульоне стафилококки и диплококки дают равномерное помутнение с выпадением обильного осадка.
При росте стрептококков на бульоне с 2 % глюкозы бульон остается прозрачным, а на дно пробирки выпадает осадок.
Патогенность стафилококков определяют реакцией коагулирования плазмы крови.
Плазму крови кролика, приготовленную по п. 3.1.16. разливают по 0.5 см' в две стерильные пробирки, в одну пробирку вносят петлей суточную агаровую культуру испытуемого стафилококка, другая пробирка является контрольной. Внесенную культуру тщательно перемешивают, после чего обе пробирки помещают в термостат при температуре 37 "С. Пробирки осторожно, избегая встряхивания, просматривают. Результаты реакции коагуляции учитывают в течение 2 4 ч и через 24 ч. Штаммы стафилококка, продуцирующие фермент плазмокоагулазу, вызывают свертывание плазмы, вследствие чего она превращается в студнеобразную массу, не выливающуюся при перевертывании пробирки. Свертывание плазмы обозначается знаком С. а посевы на висмут-сульфитном агаре — на 48 ч.
При обнаружении на чашках роста подозрительных колоний исследуют три пять колоний с каждой чашки.
почками, гроздями и в виде ланцетовидных диплококков), а также определения характера роста на питательных средах.
На мясо-пептонном бульоне стафилококки и диплококки дают равномерное помутнение с выпадением обильного осадка.
При росте стрептококков на бульоне с 2 % глюкозы бульон остается прозрачным, а на дно пробирки выпадает осадок.
Патогенность стафилококков определяют реакцией коагулирования плазмы крови.
Плазму крови кролика, приготовленную по п. 3.1.16. разливают по 0.5 см' в две стерильные пробирки, в одну пробирку вносят петлей суточную агаровую культуру испытуемого стафилококка, другая пробирка является контрольной. Внесенную культуру тщательно перемешивают, после чего обе пробирки помещают в термостат при температуре 37 "С. Пробирки осторожно, избегая встряхивания, просматривают. Результаты реакции коагуляции учитывают в течение 2 4 ч и через 24 ч. Штаммы стафилококка, продуцирующие фермент плазмокоагулазу, вызывают свертывание плазмы, вследствие чего она превращается в студнеобразную массу, не выливающуюся при перевертывании пробирки. Свертывание плазмы обозначается знаком С. а посевы на висмут-сульфитном агаре — на 48 ч.
При обнаружении на чашках роста подозрительных колоний исследуют три пять колоний с каждой чашки.
ГОСТ 21237-75 С. 16
Подозрительные колонии бактерии сальмонелл исследуют в следующем порядке: из части колонии приготовляют мазок и окрашивают по Граму, затем проводят исследование на подвижность.
Бактерии сальмонеллы, как и все бактерии семейства кишечных, представляют собой палочки с закругленными концами, песпорообразуюшие. в большинстве подвижные (Б. риИошт и galliпarum неподвижные), окрашивающиеся по Граму отрицательно.
Оставшуюся часть колонии растирают в конденсационной воде скошенного агара или водной-двух каплях добавленного к агару стерильного бульона. Полученная взвесь служит исходным материалом для дальнейшего исследования.
Часть взвеси испытывают в реакции агглютинации на предметном стекле. Реакцию ставят с поливалентной адсорбированной агглютируюшей О-сывороткой групп Д. В. С. I) и Е. В качестве контроля применяют каплю физиологического распюра.
Для проведения реакции агглютинации па предметное стекло наносят каплю поливалентной адсорбированной сыворотки и рядом каплю физиологического раствора. Затем бактериологической петлей захватывают часть взвеси и растирают ее в капле сыворотки, начиная с края капли, постепенно захватывая всю каплю. Петлю обжигают, захватывают петлей еше взвеси и вносят в каплю физиологического распюра (контрольного), также растирая до получения равномерной взвеси.
При положительной реакции через 1—2 мин в капле сыворотки образуются хлопья или комочки, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла.
В физиологическом растворе (контрольном) наблюдается равномерная муть.
При получении положительной реакции агглютинации с адсорбированной поливалентной сывороткой проводят реакиию агглютинации на стекле с адсорбированными монорецепторными О-сыво-ротками. Следует начинать с более распространенных групп В. С, I) и Е, в частности, в группе В с IV. в группе I) с IX, в группе С с VII, в группе Е с 111, X.
При отрицательной реакции агглютинации с одной колонией дополнительно исследуют еще не менее трех-четырех колоний.
При характерном росте на дифференпиалыюй среде, избирательной положительной реакции агглютинации с монорепепторной О-сывороткой и при наличии подвижных грамогрипательных палочек дается предварительное заключение о том. что выделенная культура относится к сальмонеллам.
Одновременно с реакцией агглютипаннн материал засевают на трехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука. приготовленной по п. 3.1.13.
Посев па трехсахарный агар делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Среду инкубируют в термостате в течение 16 18 ч. При наличии сальмонелл янтарный цвет среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука изменяется следующим образом: столбик — желто-бурый, скошенная поверхность цвет не изменяет. По наличию трешин и разрыву столбика агара устанавливают образование газа, по изменению окраски столбика (почернение) — наличие сероводорода.
Сальмонеллы, не образующие сероводорода, изменяют цвет столбика агара в желтый нвет. Бактерии. не относящиеся к сальмонеллам, расщепляющие мочевину, окрашивают столбик и скошенную поверхность в ярко-красный цвет, а бактерии, сбраживающие лактозу и сахарозу, изменяют цвет среды в синий.
Если культуры ферментируют лактозу и глюкозу с образованием газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелл.
Культуры, не ферментирующие лактозу и сахарозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием газа) подвергают дальнейшему исследованию, для чего культуру со среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука исследуют с мопорецепторной О-сыво-роткой (материал берут с верхней части скошенной поверхности). Затем эту культуру агглютинируют с мопорепепторнымн Н-сыворотками, сначала с первой фазой, затем со второй фазой Н-антигена. входящего в данную группу (для агглютинации с Н-сыворотками культуру берут ближе к конденсационной жидкости в пробирке, где особи более подвижны) и устанавливают серологический тип сальмонелл.
Если культуры дают отрицательные результаты агглютинации с моноренепторными О-сыворот-ками, но при характерном росте на элективной среде и соответствующих морфологических признаках (грамотрицательиые подвижные палочки) делают посев на среды с углеводами:
в короткий пестрый ряд (включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом). В бульон Хоттингера для определения образования индола и сероводорода под пробку в пробирку с бульоном помешают индикаторные бумажки, приготовленные по пп. 3.1.25 и 3.1.26.
Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 18—20 ч. после чего их просматривают под микроскопом.
Подозрительные колонии бактерии сальмонелл исследуют в следующем порядке: из части колонии приготовляют мазок и окрашивают по Граму, затем проводят исследование на подвижность.
Бактерии сальмонеллы, как и все бактерии семейства кишечных, представляют собой палочки с закругленными концами, песпорообразуюшие. в большинстве подвижные (Б. риИошт и galliпarum неподвижные), окрашивающиеся по Граму отрицательно.
Оставшуюся часть колонии растирают в конденсационной воде скошенного агара или водной-двух каплях добавленного к агару стерильного бульона. Полученная взвесь служит исходным материалом для дальнейшего исследования.
Часть взвеси испытывают в реакции агглютинации на предметном стекле. Реакцию ставят с поливалентной адсорбированной агглютируюшей О-сывороткой групп Д. В. С. I) и Е. В качестве контроля применяют каплю физиологического распюра.
Для проведения реакции агглютинации па предметное стекло наносят каплю поливалентной адсорбированной сыворотки и рядом каплю физиологического раствора. Затем бактериологической петлей захватывают часть взвеси и растирают ее в капле сыворотки, начиная с края капли, постепенно захватывая всю каплю. Петлю обжигают, захватывают петлей еше взвеси и вносят в каплю физиологического распюра (контрольного), также растирая до получения равномерной взвеси.
При положительной реакции через 1—2 мин в капле сыворотки образуются хлопья или комочки, а сама жидкость просветляется, что особенно заметно при покачивании стекла.
В физиологическом растворе (контрольном) наблюдается равномерная муть.
При получении положительной реакции агглютинации с адсорбированной поливалентной сывороткой проводят реакиию агглютинации на стекле с адсорбированными монорецепторными О-сыво-ротками. Следует начинать с более распространенных групп В. С, I) и Е, в частности, в группе В с IV. в группе I) с IX, в группе С с VII, в группе Е с 111, X.
При отрицательной реакции агглютинации с одной колонией дополнительно исследуют еще не менее трех-четырех колоний.
При характерном росте на дифференпиалыюй среде, избирательной положительной реакции агглютинации с монорепепторной О-сывороткой и при наличии подвижных грамогрипательных палочек дается предварительное заключение о том. что выделенная культура относится к сальмонеллам.
Одновременно с реакцией агглютипаннн материал засевают на трехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука. приготовленной по п. 3.1.13.
Посев па трехсахарный агар делают сначала штрихом по скошенной поверхности, а затем уколом в глубину столбика. Среду инкубируют в термостате в течение 16 18 ч. При наличии сальмонелл янтарный цвет среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука изменяется следующим образом: столбик — желто-бурый, скошенная поверхность цвет не изменяет. По наличию трешин и разрыву столбика агара устанавливают образование газа, по изменению окраски столбика (почернение) — наличие сероводорода.
Сальмонеллы, не образующие сероводорода, изменяют цвет столбика агара в желтый нвет. Бактерии. не относящиеся к сальмонеллам, расщепляющие мочевину, окрашивают столбик и скошенную поверхность в ярко-красный цвет, а бактерии, сбраживающие лактозу и сахарозу, изменяют цвет среды в синий.
Если культуры ферментируют лактозу и глюкозу с образованием газа и расщепляют мочевину, они не принадлежат к бактериям рода сальмонелл.
Культуры, не ферментирующие лактозу и сахарозу и не расщепляющие мочевину, но ферментирующие глюкозу (с образованием газа) подвергают дальнейшему исследованию, для чего культуру со среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука исследуют с мопорецепторной О-сыво-роткой (материал берут с верхней части скошенной поверхности). Затем эту культуру агглютинируют с мопорепепторнымн Н-сыворотками, сначала с первой фазой, затем со второй фазой Н-антигена. входящего в данную группу (для агглютинации с Н-сыворотками культуру берут ближе к конденсационной жидкости в пробирке, где особи более подвижны) и устанавливают серологический тип сальмонелл.
Если культуры дают отрицательные результаты агглютинации с моноренепторными О-сыворот-ками, но при характерном росте на элективной среде и соответствующих морфологических признаках (грамотрицательиые подвижные палочки) делают посев на среды с углеводами:
в короткий пестрый ряд (включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом). В бульон Хоттингера для определения образования индола и сероводорода под пробку в пробирку с бульоном помешают индикаторные бумажки, приготовленные по пп. 3.1.25 и 3.1.26.
Посевы выдерживают в термостате при температуре 37 С в течение 18—20 ч. после чего их просматривают под микроскопом.
С. II ГОСТ 21237-75
К бактериям из рода сальмонелл относятся бактерии, не ферментирующие лактозу и сахарозу и ферментирующие глюкозу и маннит (S. typhi suis не ферментирует маннит), образующие сероводород (S. cholerae suis и S. typhi suis сероводород не образуют) и не образующие индол.
При необходимости пашой типизации сальмонелл проводят посев на расширенный пестрый ряд для определения биохимических свойств и исследуют их антигенные свойства (табл. 3).
Таблица 3
•п - 5. с. 1- Тип сальмонелл Aiimrciiu Биохимические свойства
z V x fe z я • О II анш ICH Гл ю - KOltl л О ь-* я п О Б. Я * С ь- Z = Z л 2 о г •S я в. < X я л ч f z S 2 о г - г Глнисрнн ПО Штерну tn С I im £ 2 о п z о >• ! X 10 о с 2 о Z £ ч о а о "1 в а О ь о г о ■г X я X X л enz,. + + — — + + + — 4- У 4- + — 4- 4- — —
S. Heidelberg 1. 4. 5. 12 r 1, 2 + + — — + + 4- + 4- 4- 4- 4- 4- 4- — —
S. abortus cqui 4. 12 — enx + + — — — + + —+ — 4- — — 4- 4- — + 4- — —
S. abortus bovis 1. 4. 12, 27 b enx + + — — + + 4- — У 4- 4— 4- — 4- — —
S. abortus ovis 4. 12 с 1. 6 + + — — + —+ У — X — — У — + X — —
с, S. paratyphi С 6, 7 с 1. 5 + + — — + —+ 4- — — 4- — — 4- + — 4- — —
S. cholerae suis 6. 7 с 1. 5 + + — — + — X — 4- — — 4- — — — —
S. cholerae suis 6. 7 — 1. 5 + + — — + — X — — — — 4- — 4- — —
kun/endorf
S. mission 6, 7 d 1, 5 + + — — + + 4- — 4- 4- 4- 4- У 4- — —
S. montevideo 6, 7 gmx — + + — — + + 4- — 4- 4- + 4- У 4- — —
S. oraniengburd 6, 7 ml — + + — — + + 4- — 4- У 4- 4- 4- 4- — —
S. thompson 6. 7 k 1, 5 + +— — — + + 4- 4- 4- 4- + 4- 4- 4- — —
S. concord 6, 7 /V 1. 2 + + — — + + 4- — 4- 4- 4- 4- (-) + — —
S. potsdam 6. 7 Iv + — — — + + 4- + 4- 4- + + У + — —
S. borcilly 6, 7 У 1, 5 + + — — + + 4- 4- 4- 4- 4- 4- У — — —
S. typhi suis 6. 7 с 1, 5 + + — — — + —+ — —+ — -4- 4- — — — —
S. tennesscc 6, 7 z 29 — + + — — + + 4- 4- + 4- 4- 4- У 4- — —
S. mucnchen 6. 8 d 1, 2 + + — — + + 4- 4- 4- 4- + 4- 4- 4- — —
S. ncwport 6. 8 eh 1. 2 + + — — + + 4- — — 4- 4- 4- 4- 4- — —
S. bovis morbtficans 6. 8 r 1. 5 + + — — + + 4- У + 4- + 4- 4- 4- — —
S. manchcster 6. 8 h 1, 7 + + — — + + 4- — — 4- 4- 4- 4- 4- — —
S. blockicy 6. 8 k 1, 5 + + — — + + 4- 4- + 4- + 4- + 4- — —
D, S. typhi 9. 12 К d — + — — — + X X — — — 4- 4-х — 4 — — —
S. enteritidis 1. 9. 12 — + + — — + + — + 4- V + + 4- 4 — —
S. dublin 1. 9. 12 HP — + + — — (- + ) + — + 4- У 4- 4- — 4- 4 — —
S. roslock 1. 9. 12 gp.u — + + — — + + — — — — + 4- — + — 4 — —
S. moscow 9. 12 84 — + + — — + + — — — 4- 4- 4- 4- — + 4 — —
S. panama 1. 9. 12 Iv 1, 5 + + — — + + У — — 4- + 4- У 4 — —
S. dar—cs—salaam 1. 9. 12 ht enx + + — — + + — 4- 4- 4- 4- 4- У 4 — —
S. gallinaruin 1. 9. 12 — — + + — — + + + + 4- 4- — 4- — — 4 — —
S. pullomm 1. 9. 12 — — + + - - + + — + 4- 4- — 4- — — — —
К бактериям из рода сальмонелл относятся бактерии, не ферментирующие лактозу и сахарозу и ферментирующие глюкозу и маннит (S. typhi suis не ферментирует маннит), образующие сероводород (S. cholerae suis и S. typhi suis сероводород не образуют) и не образующие индол.
При необходимости пашой типизации сальмонелл проводят посев на расширенный пестрый ряд для определения биохимических свойств и исследуют их антигенные свойства (табл. 3).
Таблица 3
•п - 5. с. 1- Тип сальмонелл Aiimrciiu Биохимические свойства
z V x fe z я • О II анш ICH Гл ю - KOltl л О ь-* я п О Б. Я * С ь- Z = Z л 2 о г •S я в. < X я л ч f z S 2 о г - г Глнисрнн ПО Штерну tn С I im £ 2 о п z о >• ! X 10 о с 2 о Z £ ч о а о "1 в а О ь о г о ■г X я X X л enz,. + + — — + + + — 4- У 4- + — 4- 4- — —
S. Heidelberg 1. 4. 5. 12 r 1, 2 + + — — + + 4- + 4- 4- 4- 4- 4- 4- — —
S. abortus cqui 4. 12 — enx + + — — — + + —+ — 4- — — 4- 4- — + 4- — —
S. abortus bovis 1. 4. 12, 27 b enx + + — — + + 4- — У 4- 4— 4- — 4- — —
S. abortus ovis 4. 12 с 1. 6 + + — — + —+ У — X — — У — + X — —
с, S. paratyphi С 6, 7 с 1. 5 + + — — + —+ 4- — — 4- — — 4- + — 4- — —
S. cholerae suis 6. 7 с 1. 5 + + — — + — X — 4- — — 4- — — — —
S. cholerae suis 6. 7 — 1. 5 + + — — + — X — — — — 4- — 4- — —
kun/endorf
S. mission 6, 7 d 1, 5 + + — — + + 4- — 4- 4- 4- 4- У 4- — —
S. montevideo 6, 7 gmx — + + — — + + 4- — 4- 4- + 4- У 4- — —
S. oraniengburd 6, 7 ml — + + — — + + 4- — 4- У 4- 4- 4- 4- — —
S. thompson 6. 7 k 1, 5 + +— — — + + 4- 4- 4- 4- + 4- 4- 4- — —
S. concord 6, 7 /V 1. 2 + + — — + + 4- — 4- 4- 4- 4- (-) + — —
S. potsdam 6. 7 Iv + — — — + + 4- + 4- 4- + + У + — —
S. borcilly 6, 7 У 1, 5 + + — — + + 4- 4- 4- 4- 4- 4- У — — —
S. typhi suis 6. 7 с 1, 5 + + — — — + —+ — —+ — -4- 4- — — — —
S. tennesscc 6, 7 z 29 — + + — — + + 4- 4- + 4- 4- 4- У 4- — —
S. mucnchen 6. 8 d 1, 2 + + — — + + 4- 4- 4- 4- + 4- 4- 4- — —
S. ncwport 6. 8 eh 1. 2 + + — — + + 4- — — 4- 4- 4- 4- 4- — —
S. bovis morbtficans 6. 8 r 1. 5 + + — — + + 4- У + 4- + 4- 4- 4- — —
S. manchcster 6. 8 h 1, 7 + + — — + + 4- — — 4- 4- 4- 4- 4- — —
S. blockicy 6. 8 k 1, 5 + + — — + + 4- 4- + 4- + 4- + 4- — —
D, S. typhi 9. 12 К d — + — — — + X X — — — 4- 4-х — 4 — — —
S. enteritidis 1. 9. 12 — + + — — + + — + 4- V + + 4- 4 — —
S. dublin 1. 9. 12 HP — + + — — (- + ) + — + 4- У 4- 4- — 4- 4 — —
S. roslock 1. 9. 12 gp.u — + + — — + + — — — — + 4- — + — 4 — —
S. moscow 9. 12 84 — + + — — + + — — — 4- 4- 4- 4- — + 4 — —
S. panama 1. 9. 12 Iv 1, 5 + + — — + + У — — 4- + 4- У 4 — —
S. dar—cs—salaam 1. 9. 12 ht enx + + — — + + — 4- 4- 4- 4- 4- У 4 — —
S. gallinaruin 1. 9. 12 — — + + — — + + + + 4- 4- — 4- — — 4 — —
S. pullomm 1. 9. 12 — — + + - - + + — + 4- 4- — 4- — — — —
ГОСТ 21237-75 С. 18
Продолжение
= г >. ь 1— Ти IX сальмонелл Ант гены Биохимические свойства
х V X V-X я 1 о II анти ген Гл ю -коза 2 2 * Н 2 5 Г. 3 я и м X X X я 2 0 X X '3 с. < ^ X 2 Л 1 А =1 X О X 2 о X я О. >1 X £ 3 о с - ь я X г 1— 3 О «? 2 о & н- 2 о й X о >• ь с X ш с с 2 о X • я а. ч г о в о А V ■о с 5 я X X X о т о 3-
Я X Г X * X 0 е а я я 1 Я X ■е- X V с ё 2 я К Г1 С 5 г- У X Л Я
Е, $. апа1шп 3, 10 е/1 1.6 + +— _ _ + + + _ + + + + + _ _
8. кзпОоп 3. 10 А- 1- 6 + + — — + + + + + + + + + + — —
тсЧеа^псйх 3, 10 е/> /и' + + — — + + + + + + + + У + — —
5сс^с(Ыс1 3. 10 гП) 1, 2 + + — — + + + — + + + + У + — —
1есх1п$иоп 3, 10 г. 10 1,5 + + — — + + 4- + + + + У + — —
У слов и ыс обозначс к и я:
«—» — отрицательный результат;
*—+» — отрицательный, иногда положительный результат;
• +-» — положительный результат;
•+—• — положительный, рслкис типы отрицательные;
•У» — различные биохимические типы;
— поздний или непостоянный положительный, или отрицательный результат.
В случае выявления культур сальмонелл с отклонением от типичных свойств, для их окончательной идентификации при необходимости проводят дополнительные исследования.
Если культура обладает ферментативными свойствами, типичными для сальмонелл, но не агглютинируется сальмонеллезными О- и Н-сыворотками, следует испытать ее способность лизироваться сальмонеллезиым О-фагом.
Положительный результат реакции является дополнительным признаком, указывающим на принадлежность культуры к роду сальмонелл.
Для испытания культур на чувствительность к О-бактериофату на пластинке хорошо подсушенного щелочного агара (рН 7,2 7,4) стерильной пробиркой с ровными краями делают 5—6 насечек. На каждую насечку наносят по две капли 4- или 18-часовой бульонной культуры испытуемого штамма с помощью тонкой оттянутой пастеровской пипетки или петли. Взамен бульонной культуры можно использовать взвесь суточной агаровой культуры на физиологическом растворе.
После подсыхания культуры на нанесенные капли петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра наносят каплю О-бактериофага, на другую в качестве контроля наносят каплю бульона. Фаг наносят в разведении 10-кратном и 100-кратном (в зависимости от указанного па этикетке). На одной чашке можно испытывать одновременно 5—6 культур.
Чашки с нанесенными культурами и О-бактериофагом помешают в термостат при температуре 37 *С на 18—20 ч. после чего учитывают результаты. Положительный результат реакции определяется по появлению на месте нанесения фага четко очерченной зоны лизиса (сливного или отдельных негативных колоний), которая отчетливо видна невооруженным глазом. Отрицательный результат реакции определяют отсутствием лизиса; в местах нанесения фага имеет место рост культуры, как в контрольном месте.
О-фаг может быть использован также для предварительного испытания культуры. Дтя этого подозрительные колонии, выросшие на чашках с дифференциальной средой (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитным агаром и др.), снимают и пересевают на один из секторов чашки Петри со слабощелочным агаром. В центр каждого засеянного сектора тонкой пастеровской пипеткой или петлей наносят каплю О-фага. чашки помешают в термостат и на следующий день учитывают результаты.
4.2.4.3. Обработка результатов
Обнаружение подвижных (кроме И. риИогшп н S. £а1Нпатит) палочек, отрицательных по Граму, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты
15-1-22«.*
Продолжение
= г >. ь 1— Ти IX сальмонелл Ант гены Биохимические свойства
х V X V-X я 1 о II анти ген Гл ю -коза 2 2 * Н 2 5 Г. 3 я и м X X X я 2 0 X X '3 с. < ^ X 2 Л 1 А =1 X О X 2 о X я О. >1 X £ 3 о с - ь я X г 1— 3 О «? 2 о & н- 2 о й X о >• ь с X ш с с 2 о X • я а. ч г о в о А V ■о с 5 я X X X о т о 3-
Я X Г X * X 0 е а я я 1 Я X ■е- X V с ё 2 я К Г1 С 5 г- У X Л Я
Е, $. апа1шп 3, 10 е/1 1.6 + +— _ _ + + + _ + + + + + _ _
8. кзпОоп 3. 10 А- 1- 6 + + — — + + + + + + + + + + — —
тсЧеа^псйх 3, 10 е/> /и' + + — — + + + + + + + + У + — —
5сс^с(Ыс1 3. 10 гП) 1, 2 + + — — + + + — + + + + У + — —
1есх1п$иоп 3, 10 г. 10 1,5 + + — — + + 4- + + + + У + — —
У слов и ыс обозначс к и я:
«—» — отрицательный результат;
*—+» — отрицательный, иногда положительный результат;
• +-» — положительный результат;
•+—• — положительный, рслкис типы отрицательные;
•У» — различные биохимические типы;
— поздний или непостоянный положительный, или отрицательный результат.
В случае выявления культур сальмонелл с отклонением от типичных свойств, для их окончательной идентификации при необходимости проводят дополнительные исследования.
Если культура обладает ферментативными свойствами, типичными для сальмонелл, но не агглютинируется сальмонеллезными О- и Н-сыворотками, следует испытать ее способность лизироваться сальмонеллезиым О-фагом.
Положительный результат реакции является дополнительным признаком, указывающим на принадлежность культуры к роду сальмонелл.
Для испытания культур на чувствительность к О-бактериофату на пластинке хорошо подсушенного щелочного агара (рН 7,2 7,4) стерильной пробиркой с ровными краями делают 5—6 насечек. На каждую насечку наносят по две капли 4- или 18-часовой бульонной культуры испытуемого штамма с помощью тонкой оттянутой пастеровской пипетки или петли. Взамен бульонной культуры можно использовать взвесь суточной агаровой культуры на физиологическом растворе.
После подсыхания культуры на нанесенные капли петлей или пастеровской пипеткой меньшего диаметра наносят каплю О-бактериофага, на другую в качестве контроля наносят каплю бульона. Фаг наносят в разведении 10-кратном и 100-кратном (в зависимости от указанного па этикетке). На одной чашке можно испытывать одновременно 5—6 культур.
Чашки с нанесенными культурами и О-бактериофагом помешают в термостат при температуре 37 *С на 18—20 ч. после чего учитывают результаты. Положительный результат реакции определяется по появлению на месте нанесения фага четко очерченной зоны лизиса (сливного или отдельных негативных колоний), которая отчетливо видна невооруженным глазом. Отрицательный результат реакции определяют отсутствием лизиса; в местах нанесения фага имеет место рост культуры, как в контрольном месте.
О-фаг может быть использован также для предварительного испытания культуры. Дтя этого подозрительные колонии, выросшие на чашках с дифференциальной средой (Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитным агаром и др.), снимают и пересевают на один из секторов чашки Петри со слабощелочным агаром. В центр каждого засеянного сектора тонкой пастеровской пипеткой или петлей наносят каплю О-фага. чашки помешают в термостат и на следующий день учитывают результаты.
4.2.4.3. Обработка результатов
Обнаружение подвижных (кроме И. риИогшп н S. £а1Нпатит) палочек, отрицательных по Граму, не ферментирующих лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты
15-1-22«.*
С. II ГОСТ 21237-75
к газа (5. сурЫ яив не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с монорецепторпыми О- и Н-сальмонеллезными сыворотками, указывает па присутствие в мясе бактерий из рода сальмонелл.
4.2.5. Выявление бактерий из рода кишечной палочки Эшери-
х и й
4.2.5.1. Сушность выявления бактерий из рода кишечной палочки Эшерихий заключается в определении морфологии, характера роста на элективных средах с лактозой и отсутствия способности образовывать цитохромоксидазу, утилизировать цитрат, образовывать сероводород и способности продуцировать индол.
4.2.5.2. Проведение исследования
Наличие роста на чашках с элективными средами (Эидо, Левина. Плоскирева) окрашенных колоний, вследствие ферментации ими лактозы и изменения цвета индикатора — лактозопоюжитель-ных вариантов кишечной палочки (или не изменяющих цвета среды колоний лактозоотринательиых) требует их определения для установления присутствия их в мясе или паренхиматозных органах и дифференциации по биохимическим свойствам от других сходных бактерий из семейства кишечных.
На агаре Эндо бактерии кишечной палочки-Эшерихии растут в виде красных с металлическим блеском (или без блеска) розовых с красным центром или белых колоний; на эозин-метиленовом синем агаре (агаре Левина) в виде темно-фиолетовых блестящих колоний: на бактоагаре IГлоскирева в виде кирпично-красных с глянцевой поверхностью колоний.
Из колоний, характерных для бактерий кишечной палочки-Эшерихии, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Бактерии кишечной палочки-Эшерихии мелкие палочки с закругленными концами по Граму окрашиваются отрицательно.
Ятя определения подвижности культуры готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют.
Бактерии кишечной палочки-Эшерихии чаше подвижны.
При наличии колоний, характерных для бактерий кишечной палочки-Эшерихии, их дифференцируют от других сходных микроорганизмов по биохимическим свойствам, указанным в табл. 4.
Т а б л и ц а 4
Биохимические аиффсрсниирумшие с коцепи Рол микроба
Биохимические парианты Escherichia Proteus
1 2 3 4 S 6 Pr. Miliar» Pr. mirabili%
Образование сероводорода на
трсхсахарном агаре с двойной серно-
кислой солью -закиси железа и аммо-
нии (солью Мора) — — — — — — + 4-
Образование газа на глюкозе на
трсхсахарном агаре с двойной серно-
кислой солью закиси железа и аммо-
нии (солью Мора) + — 4- — 4- — + +
Ферментация 10 %-ной лактозы + 4- 4- + — — — —
Образование индола + 4- — — 4- 4 + —
Расщепление мочевины 4- 4-
Утилизация пиграта (на среде С'нм-
монса) Различно Рахтично
Подвижность +/- +/- +/- +/- +/— +/- + 4-
Ферментация мальтозы + 4- 4- + 4- + + _
Ферментация маннига + 4- 4- + 4- + — —
У е .1 о в и ы с об о з паче и и я: «+» — положительный результат; •—» — отрицательный результат;
«+/—» — положительный или отрицательный результат.
к газа (5. сурЫ яив не ферментирует маннит), дающих положительную реакцию агглютинации с монорецепторпыми О- и Н-сальмонеллезными сыворотками, указывает па присутствие в мясе бактерий из рода сальмонелл.
4.2.5. Выявление бактерий из рода кишечной палочки Эшери-
х и й
4.2.5.1. Сушность выявления бактерий из рода кишечной палочки Эшерихий заключается в определении морфологии, характера роста на элективных средах с лактозой и отсутствия способности образовывать цитохромоксидазу, утилизировать цитрат, образовывать сероводород и способности продуцировать индол.
4.2.5.2. Проведение исследования
Наличие роста на чашках с элективными средами (Эидо, Левина. Плоскирева) окрашенных колоний, вследствие ферментации ими лактозы и изменения цвета индикатора — лактозопоюжитель-ных вариантов кишечной палочки (или не изменяющих цвета среды колоний лактозоотринательиых) требует их определения для установления присутствия их в мясе или паренхиматозных органах и дифференциации по биохимическим свойствам от других сходных бактерий из семейства кишечных.
На агаре Эндо бактерии кишечной палочки-Эшерихии растут в виде красных с металлическим блеском (или без блеска) розовых с красным центром или белых колоний; на эозин-метиленовом синем агаре (агаре Левина) в виде темно-фиолетовых блестящих колоний: на бактоагаре IГлоскирева в виде кирпично-красных с глянцевой поверхностью колоний.
Из колоний, характерных для бактерий кишечной палочки-Эшерихии, готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют.
Бактерии кишечной палочки-Эшерихии мелкие палочки с закругленными концами по Граму окрашиваются отрицательно.
Ятя определения подвижности культуры готовят препарат «раздавленная капля» и микроскопируют.
Бактерии кишечной палочки-Эшерихии чаше подвижны.
При наличии колоний, характерных для бактерий кишечной палочки-Эшерихии, их дифференцируют от других сходных микроорганизмов по биохимическим свойствам, указанным в табл. 4.
Т а б л и ц а 4
Биохимические аиффсрсниирумшие с коцепи Рол микроба
Биохимические парианты Escherichia Proteus
1 2 3 4 S 6 Pr. Miliar» Pr. mirabili%
Образование сероводорода на
трсхсахарном агаре с двойной серно-
кислой солью -закиси железа и аммо-
нии (солью Мора) — — — — — — + 4-
Образование газа на глюкозе на
трсхсахарном агаре с двойной серно-
кислой солью закиси железа и аммо-
нии (солью Мора) + — 4- — 4- — + +
Ферментация 10 %-ной лактозы + 4- 4- + — — — —
Образование индола + 4- — — 4- 4 + —
Расщепление мочевины 4- 4-
Утилизация пиграта (на среде С'нм-
монса) Различно Рахтично
Подвижность +/- +/- +/- +/- +/— +/- + 4-
Ферментация мальтозы + 4- 4- + 4- + + _
Ферментация маннига + 4- 4- + 4- + — —
У е .1 о в и ы с об о з паче и и я: «+» — положительный результат; •—» — отрицательный результат;
«+/—» — положительный или отрицательный результат.
ГОСТ 21237-75 С. 20
Для определения сероводорода испытуемую культуру засевают на трехсахарный агар, приготовленный по п. 3.1.13 уколом столбик, и помещают в термостат на 24 ч при температуре 37 "С.
Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не образуют сероводорода, и столбик агара почернения не дает.
Для установления способности бактерий кишечной палочки-Эшерихии расщеплять мочевину, испытуемую культуру засевают на трехсахарный агар с мочевиной и выдерживают 24 ч в термостате при температуре 37 "С. Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не расщепляют мочевину и не изменяют цвет среды. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, реакция среды становится резко щелочной, и среда окрашивается в ярко-красный цвет.
Ферментацию лактозы устанавливают посевом испытуемой культуры кишечной палочки-Эшерихии в среду Гисса, содержащую 10 % лактозы, большинство бактерий кишечной палочки-Эшерихии ферментируют 10 %-ну ю лактозу.
Индол определяют при помощи индикаторной бумажки, приготовленной по и. 3.1.25, бактерии кишечной палочки-Эшерихии чаше образуют индол и окрашивают индикаторную бумажку в красный цвет.
Для определения способности утилизировать цитраты испытуемую культуру засевают на скошенный агар Симмонса, приготовленный по п. 3.1.19. посевы помешают в термостат на 24 ч при температуре 37 "С. Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не растут на этой среде и не меняют ее цвета, бактерии, ассимилирующие цитрат, растут, подщелачивая среду н изменяя ее цвет из оливково-зеленого в синий.
4.2.5.3. Обработка результатов
Обнаружение отрицательных по Граму палочек, образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, ферментирующих 10 %-ную лактозу, образующих индол, не расщепляющих мочевину, не ассимилирующих цитраты, не образующих сероводород, указывает на наличие бактерий кишечной палочки-Эшерихии.
4.2.6. Выявление бактерий из рода протея
4.2.6.1. Сущность метода выявления бактерий из рода протея заключается в определении морфологии, определении роста на питательных средах и способности гидролизовать мочевину, образовании сероводорода и отсутствии ферментации маннита.
4.2.6.2. Проведение исаедования
Наличие на средах в чашках вуалеобразного налета (Н-форма), при микроскопии которого обнаруживают полиморфные подвижные палочки, окрашивающиеся по Граму отрицательно, указывает на присутствие вульгарного протея: наряду с колониями, которые дают расплывающийся по поверхности рост, могут встречаться изолированные колонии средней величины, нежные полупрозрачные с розоватым центром, палочки из этих колоний лишены жгутиков и неподвижны (О-форма).
Дчя подтверждения наличия протея (Н-форма) производят посев в конденсационную воду скошенного агара (способ Шукевича).
Дчя обнаружения «нероящихся» О-форм производят посев на агар 11лоскирева. О-форма протея растет на этой среде в виде прозрачных колоний, обладающих характерным запахом и слегка подщелачивающих среду, которая окрашивается около них в желтый цвет. Более старые колонии нередко мутнеют, а их центр принимает бурую окраску.
Биохимические свойства бактерий из рода протея приведены в табл. 4.
4.2.6.3. Обработка результатов
Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, образующих характерный рост на средах Н-форма, подвижных (О-форма неподвижные), ферментирующих глюкозу и мочевину, не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие бактерий из рода протея.
4.3. Метод ускоренного выявления возбудителей рожи свиней, листериоза, сальмонелле за при помощи флуоресцирующих антител
4.3.1. Сущность метода заключается в определении способности антител иммунных сывороток при соединении через карбамидиые группы со специальными красителями (флуорохромами) вступать в специфическую связь с соответствующими антигенами. Образующийся при этом комплекс «антиген—антитело» флуоресцирует и легко обнаруживается при люминесцентной микроскопии.
Метод может быть применен в качестве экспрессного и для ускоренной идентификации микробов.
Экспрессный метод проводится в начале исследования наряду с бактериоскопией и не требует выделения чистой культуры микробов из исследуемого материала. 11олученный в течение 2—6 ч ответ яачяется предварительным, сигнальным, требующим подтверждения бактериологическим методом.
Для определения сероводорода испытуемую культуру засевают на трехсахарный агар, приготовленный по п. 3.1.13 уколом столбик, и помещают в термостат на 24 ч при температуре 37 "С.
Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не образуют сероводорода, и столбик агара почернения не дает.
Для установления способности бактерий кишечной палочки-Эшерихии расщеплять мочевину, испытуемую культуру засевают на трехсахарный агар с мочевиной и выдерживают 24 ч в термостате при температуре 37 "С. Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не расщепляют мочевину и не изменяют цвет среды. При наличии бактерий, расщепляющих мочевину, реакция среды становится резко щелочной, и среда окрашивается в ярко-красный цвет.
Ферментацию лактозы устанавливают посевом испытуемой культуры кишечной палочки-Эшерихии в среду Гисса, содержащую 10 % лактозы, большинство бактерий кишечной палочки-Эшерихии ферментируют 10 %-ну ю лактозу.
Индол определяют при помощи индикаторной бумажки, приготовленной по и. 3.1.25, бактерии кишечной палочки-Эшерихии чаше образуют индол и окрашивают индикаторную бумажку в красный цвет.
Для определения способности утилизировать цитраты испытуемую культуру засевают на скошенный агар Симмонса, приготовленный по п. 3.1.19. посевы помешают в термостат на 24 ч при температуре 37 "С. Бактерии кишечной палочки-Эшерихии не растут на этой среде и не меняют ее цвета, бактерии, ассимилирующие цитрат, растут, подщелачивая среду н изменяя ее цвет из оливково-зеленого в синий.
4.2.5.3. Обработка результатов
Обнаружение отрицательных по Граму палочек, образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, ферментирующих 10 %-ную лактозу, образующих индол, не расщепляющих мочевину, не ассимилирующих цитраты, не образующих сероводород, указывает на наличие бактерий кишечной палочки-Эшерихии.
4.2.6. Выявление бактерий из рода протея
4.2.6.1. Сущность метода выявления бактерий из рода протея заключается в определении морфологии, определении роста на питательных средах и способности гидролизовать мочевину, образовании сероводорода и отсутствии ферментации маннита.
4.2.6.2. Проведение исаедования
Наличие на средах в чашках вуалеобразного налета (Н-форма), при микроскопии которого обнаруживают полиморфные подвижные палочки, окрашивающиеся по Граму отрицательно, указывает на присутствие вульгарного протея: наряду с колониями, которые дают расплывающийся по поверхности рост, могут встречаться изолированные колонии средней величины, нежные полупрозрачные с розоватым центром, палочки из этих колоний лишены жгутиков и неподвижны (О-форма).
Дчя подтверждения наличия протея (Н-форма) производят посев в конденсационную воду скошенного агара (способ Шукевича).
Дчя обнаружения «нероящихся» О-форм производят посев на агар 11лоскирева. О-форма протея растет на этой среде в виде прозрачных колоний, обладающих характерным запахом и слегка подщелачивающих среду, которая окрашивается около них в желтый цвет. Более старые колонии нередко мутнеют, а их центр принимает бурую окраску.
Биохимические свойства бактерий из рода протея приведены в табл. 4.
4.2.6.3. Обработка результатов
Обнаружение полиморфных грамотрицательных палочек, образующих характерный рост на средах Н-форма, подвижных (О-форма неподвижные), ферментирующих глюкозу и мочевину, не ферментирующих лактозу и маннит, указывает на наличие бактерий из рода протея.
4.3. Метод ускоренного выявления возбудителей рожи свиней, листериоза, сальмонелле за при помощи флуоресцирующих антител
4.3.1. Сущность метода заключается в определении способности антител иммунных сывороток при соединении через карбамидиые группы со специальными красителями (флуорохромами) вступать в специфическую связь с соответствующими антигенами. Образующийся при этом комплекс «антиген—антитело» флуоресцирует и легко обнаруживается при люминесцентной микроскопии.
Метод может быть применен в качестве экспрессного и для ускоренной идентификации микробов.
Экспрессный метод проводится в начале исследования наряду с бактериоскопией и не требует выделения чистой культуры микробов из исследуемого материала. 11олученный в течение 2—6 ч ответ яачяется предварительным, сигнальным, требующим подтверждения бактериологическим методом.
С. II ГОСТ 21237-75
Применение метода люминесцирующих сывороток для идентификации выделенной культуры микробов имеет целыо ускорение исследования, исключающего в ряде случаев определение культу-ральных и биохимических свойств, серологические реакции и типирование.
4.3.2. Аппаратура, материалы и реактивы
При проведении исследования применяют дополнительно аппаратуру, материалы и реактивы, кроме указанных в разд. 2:
микроскоп люминесцентный или люминесцентное устройство ОИ -17 с приставкой к биологическому микроскопу;
сыворотки против рожи свиней флуоресцирующие; сыворотки против л истериоза серотипов 1,4а. 46. флуоресцирующие; сыворотки фтуореспируюшие групповые и комплексные сальмонеллезные; сыворотка поливалентная сальмонеллезная;
сыворотка (меченая ФИ'ГЦ) против гамма-глобулинов кратка, ослиная; альбумин из крови крупного рогатого скота, меченый родамином:
масло нефтуоресцирующее иммерсионное или его заменитель, изготовленный издиметилфталата чистого 100 см', нафталина сублимированного — 1,75 г или тимола чистого 5 г; глицерин с фосфатным буфером (в разведении 9:1 рН буфера 8.0); раствор физиологический с фосфатным буфером, рН 7.4.
4.3.3. Подготовка к исследованию Приготовление физиологического раствора с фосфатным буфером.
На аналитических весах отвешивают 9.078 г х.ч. однозамещенного фосфата калия, помешают его в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1000 см\ Затем отвешивают 11.876 гдвузаме-шенного фосфата натрия и в другой мерной колбе доводят дистиллированной водой до объема 1000 см\ При использовании двузамешенного фосфата натрия, содержащего 12 молекул воды, для получения 1000 см' раствора берут навеску массой 23.752 г. а безводного реактива — 9.476 г. Для получения буфера с рН 7.4 смешивают четыре части раствора двузамешенного фосфата натрия и одну часть раствора однозамещенного фосфата калия. Полученный буфер добавляют к физиологическому раствору в соотношении 1:50.
Если при смешивании фосфатов (4:1) не получают рН 8.0. то изменяя соотношение растворов, достигают необходимой величины рН (при повышенной кислотности добавляют двузамешенный фосфат натрия, а при щелочном рН добавляют однозамешенный фосфат катя).
Если при добавлении буфера в соотношении 1:50 к физиологическому раствору последний будет иметь рН ниже 7.4, то увеличением количества добавленного буфера добиваются нужной реакции физнаадгического раствора.
4.3.4. Проведение л ю м и н е с ц е н т н о-с е р о л о г и ч е с к о г о исследования возбудителей рожи свиней и л и с т е р и оз а в культуре
Для исследования используют 18—24-часовые чистые или смешанные культуры, из которых готовят по три мазка на отдельных предметных стеклах. Один из мазков используют для обработки рожистой люминесиируюшей сывороткой, два других — для обработки листериозными люминесциру-юшими сыворотками (серотипов 1. 4а. 46).
Перед применением флюоресцирующую сыворотку разводят физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7.4) до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Сыворотки в рабочем разведении могут храниться при температуре 2—4 'С в течение 2 суток.
Мазки готовят средней густоты (несколько десятков микробов в поле зрения микроскопа) размером не более 1 см1.
Место нанесения культуры очерчивают карандашом по стеклу с обратной стороны, подсушивают мазки на воздухе, маркируют и фиксируют этиловым спиртом в течение 15 мни; мазки для фиксации погружают в вертикальном положении в стеклянный сосуд со спиртом. Каждое стекло отделяют металлической проволочкой или стеклянной соломкой.
После фиксации и испарения спирта мазки ополаскивают физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7.4). На слегка подсушенный мазок наносят одну-две капли соответствующей люми-несцирующей сыворотки в рабочем разведении.
Мазки с сывороткой помешают во влажную камеру (в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) и выдерживают в термостате при температуре 37 "С в течение 30 мин.
Допускается мазки ополаскивать физиологическим раствором или дистиллированной водой без осфат1 юго буфера.
Применение метода люминесцирующих сывороток для идентификации выделенной культуры микробов имеет целыо ускорение исследования, исключающего в ряде случаев определение культу-ральных и биохимических свойств, серологические реакции и типирование.
4.3.2. Аппаратура, материалы и реактивы
При проведении исследования применяют дополнительно аппаратуру, материалы и реактивы, кроме указанных в разд. 2:
микроскоп люминесцентный или люминесцентное устройство ОИ -17 с приставкой к биологическому микроскопу;
сыворотки против рожи свиней флуоресцирующие; сыворотки против л истериоза серотипов 1,4а. 46. флуоресцирующие; сыворотки фтуореспируюшие групповые и комплексные сальмонеллезные; сыворотка поливалентная сальмонеллезная;
сыворотка (меченая ФИ'ГЦ) против гамма-глобулинов кратка, ослиная; альбумин из крови крупного рогатого скота, меченый родамином:
масло нефтуоресцирующее иммерсионное или его заменитель, изготовленный издиметилфталата чистого 100 см', нафталина сублимированного — 1,75 г или тимола чистого 5 г; глицерин с фосфатным буфером (в разведении 9:1 рН буфера 8.0); раствор физиологический с фосфатным буфером, рН 7.4.
4.3.3. Подготовка к исследованию Приготовление физиологического раствора с фосфатным буфером.
На аналитических весах отвешивают 9.078 г х.ч. однозамещенного фосфата калия, помешают его в мерную колбу и доводят дистиллированной водой до 1000 см\ Затем отвешивают 11.876 гдвузаме-шенного фосфата натрия и в другой мерной колбе доводят дистиллированной водой до объема 1000 см\ При использовании двузамешенного фосфата натрия, содержащего 12 молекул воды, для получения 1000 см' раствора берут навеску массой 23.752 г. а безводного реактива — 9.476 г. Для получения буфера с рН 7.4 смешивают четыре части раствора двузамешенного фосфата натрия и одну часть раствора однозамещенного фосфата калия. Полученный буфер добавляют к физиологическому раствору в соотношении 1:50.
Если при смешивании фосфатов (4:1) не получают рН 8.0. то изменяя соотношение растворов, достигают необходимой величины рН (при повышенной кислотности добавляют двузамешенный фосфат натрия, а при щелочном рН добавляют однозамешенный фосфат катя).
Если при добавлении буфера в соотношении 1:50 к физиологическому раствору последний будет иметь рН ниже 7.4, то увеличением количества добавленного буфера добиваются нужной реакции физнаадгического раствора.
4.3.4. Проведение л ю м и н е с ц е н т н о-с е р о л о г и ч е с к о г о исследования возбудителей рожи свиней и л и с т е р и оз а в культуре
Для исследования используют 18—24-часовые чистые или смешанные культуры, из которых готовят по три мазка на отдельных предметных стеклах. Один из мазков используют для обработки рожистой люминесиируюшей сывороткой, два других — для обработки листериозными люминесциру-юшими сыворотками (серотипов 1. 4а. 46).
Перед применением флюоресцирующую сыворотку разводят физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7.4) до рабочего разведения, указанного на этикетке ампулы. Сыворотки в рабочем разведении могут храниться при температуре 2—4 'С в течение 2 суток.
Мазки готовят средней густоты (несколько десятков микробов в поле зрения микроскопа) размером не более 1 см1.
Место нанесения культуры очерчивают карандашом по стеклу с обратной стороны, подсушивают мазки на воздухе, маркируют и фиксируют этиловым спиртом в течение 15 мни; мазки для фиксации погружают в вертикальном положении в стеклянный сосуд со спиртом. Каждое стекло отделяют металлической проволочкой или стеклянной соломкой.
После фиксации и испарения спирта мазки ополаскивают физиологическим раствором с фосфатным буфером (рН 7.4). На слегка подсушенный мазок наносят одну-две капли соответствующей люми-несцирующей сыворотки в рабочем разведении.
Мазки с сывороткой помешают во влажную камеру (в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне) и выдерживают в термостате при температуре 37 "С в течение 30 мин.
Допускается мазки ополаскивать физиологическим раствором или дистиллированной водой без осфат1 юго буфера.
ГОСТ 21237-75 С. 22
Затем сыворотку отмывают, погружая мазки в кювету, содержащую физиологический раствор с фосфатным буфером рН 7.4 на 20 мин. Раствор в кювете периодически помешивают и меняют через 10 мин.
Отмытые мазки ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Для быстроты высушивания можно использовать вентилятор.
4.3.4.1. На поверхность мазка наносят небольшую каплю глицерина с буфером рН 8,0. накрывают покровным стеклом, излишек глицерина удаляют.
На покровное стекло наносят нефлуоресцируюшее иммерсионное масло или его заменитель и производят люминесцентную микроскопию.
4.3.4.2. Диагностическая оценка интенсивности свечения возбудителей рожи свиней и листериоза: «+ + + +» яркая, сверкающая зеленая люминесценция морфологически типичных бактерий с
более интенсивным свечением но их периферии (положительная);
«+ + +» отчетливо выраженная, достаточно яркая, зеленоватая люминесценция морфологически типичных бактерий с более интенсивным свечением по их периферии (положительная):
раствором хлористого натрия (рН 7,2 7.4) на одно разведение меньше, чем их рабочие тигры, указанные на этикетках препаратов. Разведенную флуоресцирующую сыворотку и альбумин, меченый родамином, смешивают в равных объемах. Рабочую смесь хранят в пробирке с плотной резиновой пробкой в темном месте при температуре 4 С.
Затем сыворотку отмывают, погружая мазки в кювету, содержащую физиологический раствор с фосфатным буфером рН 7.4 на 20 мин. Раствор в кювете периодически помешивают и меняют через 10 мин.
Отмытые мазки ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе. Для быстроты высушивания можно использовать вентилятор.
4.3.4.1. На поверхность мазка наносят небольшую каплю глицерина с буфером рН 8,0. накрывают покровным стеклом, излишек глицерина удаляют.
На покровное стекло наносят нефлуоресцируюшее иммерсионное масло или его заменитель и производят люминесцентную микроскопию.
4.3.4.2. Диагностическая оценка интенсивности свечения возбудителей рожи свиней и листериоза: «+ + + +» яркая, сверкающая зеленая люминесценция морфологически типичных бактерий с
более интенсивным свечением но их периферии (положительная);
«+ + +» отчетливо выраженная, достаточно яркая, зеленоватая люминесценция морфологически типичных бактерий с более интенсивным свечением по их периферии (положительная):
раствором хлористого натрия (рН 7,2 7.4) на одно разведение меньше, чем их рабочие тигры, указанные на этикетках препаратов. Разведенную флуоресцирующую сыворотку и альбумин, меченый родамином, смешивают в равных объемах. Рабочую смесь хранят в пробирке с плотной резиновой пробкой в темном месте при температуре 4 С.
С. II ГОСТ 21237-75
4.3.7.1. Проведение люминесценпию*сераюгического исследования сальмонелл и культуре прямым способом
Исследованию подлежат молодые, чистые или смешанные культуры, выращенные в жидких или лучше на плотных элективных средах после появления макроскопически видимого роста.
Издвух-трех типичных для сальмонелл колоний готовят мазки на предметных стеклах соответственно числу сывороток, которые должны быть применимы для исследования.
Препараты помещают в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне. на каждый мазок наносят одну-две капли сыворотки в рабочем разведении или сыворотку с альбумином, меченым родамином, сыворотку распределяют по всей поверхности мазка и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин или в термостате при температуре 37 "С в течение 15 мин. Затем сыворотку отмывают дважды по 10 мин 0.15 моль/дм' раствором хлористого натрия. Отмытые мазки ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе или в термостате.
Обработку и микроскопию мазков производят по п. 4.3.4.1.
4.3.7.2. Проведение люминесцентно-серологического исследования са.льмонелл и мясе и паренхиматозных органах прямым способом
В свежих пробах при отсутствии патологических изменений типичные формы сальмонелл можно обнаружить в редких случаях. Поэтому люминесцентную микроскопию проводят после накопления сальмонелл. Ятя этого от всех органов отрезают кусочки размером 2 3 4 см и помещают их в закрытых чашках в термостат на 4—6 ч для подращивания; их исследуют при отрицательном результате первичной микроскопии.
Готовят две серии мазков-отпечатков (по три мазка в каждой серии). Одну серию мазков окрашивают по Граму и исследуют по общепринятой методике. Вторую серию окрашивают люминеспирую-шими сальмонеллезными сыворотками или смесью люминесцирующей сальмонеллезной сыворотки с альбумином, меченым родамином. Окраску ведут аналогично окраске сальмонелл в культуре.
Обработку и микроскопию производят по п. 4.3.4.1.
4.3.7.3. Диагностическая оценка интенсивности свечения са.1ьмоне.ы
При микроскопии мазков из культу ры или мазков-отпечатков из органов и тканей бактерии сальмонелл лают яркое изумрудно-зеленоватое свечение по периферии бактерий с хорошо выраженной центральной темной зоной. Фон препарата темный с оранжево-красным окрашиванием посторонней микрофлоры, тканевых элементов и других органических частиц (при применении альбумина, меченого родамином), содержащихся в исследуемых препаратах.
Характерное свечение конту ра (ободка) при визуальном осмотре оценивается в крестах:
«+ + + +»- сияющее зеленовато-желтоватое свечение;
«+ + +» яркое желтовато-зеленоватое свечение;
»+ +*» умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свечение отчетливо заметного контура;
С.
4.3.7.1. Проведение люминесценпию*сераюгического исследования сальмонелл и культуре прямым способом
Исследованию подлежат молодые, чистые или смешанные культуры, выращенные в жидких или лучше на плотных элективных средах после появления макроскопически видимого роста.
Издвух-трех типичных для сальмонелл колоний готовят мазки на предметных стеклах соответственно числу сывороток, которые должны быть применимы для исследования.
Препараты помещают в чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой на дне. на каждый мазок наносят одну-две капли сыворотки в рабочем разведении или сыворотку с альбумином, меченым родамином, сыворотку распределяют по всей поверхности мазка и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин или в термостате при температуре 37 "С в течение 15 мин. Затем сыворотку отмывают дважды по 10 мин 0.15 моль/дм' раствором хлористого натрия. Отмытые мазки ополаскивают дистиллированной водой и высушивают на воздухе или в термостате.
Обработку и микроскопию мазков производят по п. 4.3.4.1.
4.3.7.2. Проведение люминесцентно-серологического исследования са.льмонелл и мясе и паренхиматозных органах прямым способом
В свежих пробах при отсутствии патологических изменений типичные формы сальмонелл можно обнаружить в редких случаях. Поэтому люминесцентную микроскопию проводят после накопления сальмонелл. Ятя этого от всех органов отрезают кусочки размером 2 3 4 см и помещают их в закрытых чашках в термостат на 4—6 ч для подращивания; их исследуют при отрицательном результате первичной микроскопии.
Готовят две серии мазков-отпечатков (по три мазка в каждой серии). Одну серию мазков окрашивают по Граму и исследуют по общепринятой методике. Вторую серию окрашивают люминеспирую-шими сальмонеллезными сыворотками или смесью люминесцирующей сальмонеллезной сыворотки с альбумином, меченым родамином. Окраску ведут аналогично окраске сальмонелл в культуре.
Обработку и микроскопию производят по п. 4.3.4.1.
4.3.7.3. Диагностическая оценка интенсивности свечения са.1ьмоне.ы
При микроскопии мазков из культу ры или мазков-отпечатков из органов и тканей бактерии сальмонелл лают яркое изумрудно-зеленоватое свечение по периферии бактерий с хорошо выраженной центральной темной зоной. Фон препарата темный с оранжево-красным окрашиванием посторонней микрофлоры, тканевых элементов и других органических частиц (при применении альбумина, меченого родамином), содержащихся в исследуемых препаратах.
Характерное свечение конту ра (ободка) при визуальном осмотре оценивается в крестах:
«+ + + +»- сияющее зеленовато-желтоватое свечение;
«+ + +» яркое желтовато-зеленоватое свечение;
»+ +*» умеренное желтовато-зеленоватое или беловатое свечение отчетливо заметного контура;
С.
ГОСТ 21237-75 С. 24
Второй этап. Окраска мазков из культур, мазков-отпечатков люмниесцирующей сывороткой против гамма-глобулина кролика (меченого ФИТЦ) или смесыо сыворотки с альбумином, меченым родамином.
При окраске смесью люмниесцирующей сыворотки против гамма-глобулина кролика (меченого ФИШ) или смесыо люмниесцирующей сыворотки с альбумином, меченым родамином, готовят рабочую смесь, как указано в п. 4.3.7.
Обработку и микроскопию мазков производят по п. 4.3.4.1. Диагностическую оценку интенсивности свечения производят по п. 4.3.7.3.
4.4. Метод выявления анаэробных бактерий
4.4.1. Сущность метода выявления анаэробных бактерий заключается в определении их способности расти в отсутствии кислорода воздуха, морфологии возбудителей, роста на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.
Удовлетворительные анаэробные условия создаются в жидкой питательной среде, где в качестве восстановителя применяют мясо, печень, которые одновременно служат и источником питания.
Среда должна быть фасована во фтаконы или пробирки таким образом, чтобы площадь поверхности среды по абсолютной величине не превышала '/1(, ее объема, и поверхность ее была изолирована от кислорода воздуха.
Исследование на анаэробные бактерии проводят при подозрении на следующие заболевания: эмфизематозный карбункул (эмкар), злокачественный раневой газовый отек, брадзот овец, дизентерию ягнят, энтеротоксемию овен, столбняк, некробактериоз. ботулизм.
4.4.2. Проведение исследования
Материалом для исследования при эмкаре и злокачественном раневом газовом отеке яатяются кусочки пораженных мышц, отечные ткани, лимфатические узлы, печень и селезенка: при брадзоте овец кровь из сердца, слизистая оболочка сычуга и тонкого отдела кишечника, инфильтрат подкожной клетчатки; при дизентерии ягнят и энтеротоксемин овен содержимое кишечника, пораженная почка; при столбняке раневой секрет, гной, кусочки тканей, которые берут из глубоких слоев пораженных участков: при пекробактернозе некротические фокусы паренхиматозных органов; при ботулизме — содержимое желудка, толстых кишок, селезенка, кусок печени и головной мозг.
Диагноз на анаэробные инфекции ставят на основании бактериоскопии, посева материала и биопробы на животных.
Для бактериоскопии из материала готовят несколько мазков или мазков-отпечатков, которые окрашивают метиленовой сипью или по Граму.
При просмотре мазков обращают внимание на форму, расположение отдельных микробов, наличие и расположение спор, наличие капсул и отношение к окраске по Граму.
Для посева материал обжигают и навеску массой 10 г растирают в стерильной ступке с добавлением двойного количества физиологического раствора.
По 3 5 см' приготовленной взвеси засевают в четыре большие пробирки с мясной средой типа Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толшиной 0.5 см, предварительно прогретой в кипящей водяной бане в течение 20 30 мин. а затем быстро охлажденной до температуры не ниже 50 С. Посевы перед термостатированнем прогревают для всех указанных анаэробов две пробирки при температуре 80 С в течение 20 мин; при исследовании на С1. ЬошПпиш типа Е одну пробирку при температуре 60 'С в течение 15 мин (при этом сохраняются споры С1. ЬошПпит типа Е), а другую при 80 С в течение 20 мин. Остальные пробирки оставляют пепрогретыми.
При подозрении на С!. ЬошНпит для выявления типа Е две пробирки — одну непрогретую и одну прогретую при 60 'С выдерживают при температуре 28 "С. Другие две пробирки (непрогретую и прогрету ю при 80 'С) инкубируют при температуре 37 'С на другие анаэробные бактерии.
Термостатировапие проводят в течение 5—10 суток: наблюдение за ростом производят ежедневно. При обнаружении роста производят микроскопическое исследование.
Морфология и характер роста на среде Кнтт-Тароннн отдельных патогенных анаэробных бактерий приведены в табл. 5.
Выделение чистой культуры производится последующей методике (метод рассева по Вейону— Виньялю).
На мартеновском бульоне готовят полужидкий агар (0.5 %) с 0.5 % глюкозы и разливают в пробирки по 9 см '; агар подогревают до температуры 55 'С и производят посев в убывающем порядке: в первую пробирку засевают 1 см1 культуры из бульона Китг-Тароцци. во вторую — 1 см* из первой пробирки, в третью I см' из второй и так до пятой пробирки.
Второй этап. Окраска мазков из культур, мазков-отпечатков люмниесцирующей сывороткой против гамма-глобулина кролика (меченого ФИТЦ) или смесыо сыворотки с альбумином, меченым родамином.
При окраске смесью люмниесцирующей сыворотки против гамма-глобулина кролика (меченого ФИШ) или смесыо люмниесцирующей сыворотки с альбумином, меченым родамином, готовят рабочую смесь, как указано в п. 4.3.7.
Обработку и микроскопию мазков производят по п. 4.3.4.1. Диагностическую оценку интенсивности свечения производят по п. 4.3.7.3.
4.4. Метод выявления анаэробных бактерий
4.4.1. Сущность метода выявления анаэробных бактерий заключается в определении их способности расти в отсутствии кислорода воздуха, морфологии возбудителей, роста на питательных средах и на выявлении патогенности возбудителей путем заражения лабораторных животных.
Удовлетворительные анаэробные условия создаются в жидкой питательной среде, где в качестве восстановителя применяют мясо, печень, которые одновременно служат и источником питания.
Среда должна быть фасована во фтаконы или пробирки таким образом, чтобы площадь поверхности среды по абсолютной величине не превышала '/1(, ее объема, и поверхность ее была изолирована от кислорода воздуха.
Исследование на анаэробные бактерии проводят при подозрении на следующие заболевания: эмфизематозный карбункул (эмкар), злокачественный раневой газовый отек, брадзот овец, дизентерию ягнят, энтеротоксемию овен, столбняк, некробактериоз. ботулизм.
4.4.2. Проведение исследования
Материалом для исследования при эмкаре и злокачественном раневом газовом отеке яатяются кусочки пораженных мышц, отечные ткани, лимфатические узлы, печень и селезенка: при брадзоте овец кровь из сердца, слизистая оболочка сычуга и тонкого отдела кишечника, инфильтрат подкожной клетчатки; при дизентерии ягнят и энтеротоксемин овен содержимое кишечника, пораженная почка; при столбняке раневой секрет, гной, кусочки тканей, которые берут из глубоких слоев пораженных участков: при пекробактернозе некротические фокусы паренхиматозных органов; при ботулизме — содержимое желудка, толстых кишок, селезенка, кусок печени и головной мозг.
Диагноз на анаэробные инфекции ставят на основании бактериоскопии, посева материала и биопробы на животных.
Для бактериоскопии из материала готовят несколько мазков или мазков-отпечатков, которые окрашивают метиленовой сипью или по Граму.
При просмотре мазков обращают внимание на форму, расположение отдельных микробов, наличие и расположение спор, наличие капсул и отношение к окраске по Граму.
Для посева материал обжигают и навеску массой 10 г растирают в стерильной ступке с добавлением двойного количества физиологического раствора.
По 3 5 см' приготовленной взвеси засевают в четыре большие пробирки с мясной средой типа Тароцци, залитой слоем вазелинового масла толшиной 0.5 см, предварительно прогретой в кипящей водяной бане в течение 20 30 мин. а затем быстро охлажденной до температуры не ниже 50 С. Посевы перед термостатированнем прогревают для всех указанных анаэробов две пробирки при температуре 80 С в течение 20 мин; при исследовании на С1. ЬошПпиш типа Е одну пробирку при температуре 60 'С в течение 15 мин (при этом сохраняются споры С1. ЬошПпит типа Е), а другую при 80 С в течение 20 мин. Остальные пробирки оставляют пепрогретыми.
При подозрении на С!. ЬошНпит для выявления типа Е две пробирки — одну непрогретую и одну прогретую при 60 'С выдерживают при температуре 28 "С. Другие две пробирки (непрогретую и прогрету ю при 80 'С) инкубируют при температуре 37 'С на другие анаэробные бактерии.
Термостатировапие проводят в течение 5—10 суток: наблюдение за ростом производят ежедневно. При обнаружении роста производят микроскопическое исследование.
Морфология и характер роста на среде Кнтт-Тароннн отдельных патогенных анаэробных бактерий приведены в табл. 5.
Выделение чистой культуры производится последующей методике (метод рассева по Вейону— Виньялю).
На мартеновском бульоне готовят полужидкий агар (0.5 %) с 0.5 % глюкозы и разливают в пробирки по 9 см '; агар подогревают до температуры 55 'С и производят посев в убывающем порядке: в первую пробирку засевают 1 см1 культуры из бульона Китг-Тароцци. во вторую — 1 см* из первой пробирки, в третью I см' из второй и так до пятой пробирки.
Страница 26
С. II ГОСТ 21237-75
Т а 6 л к ц а 5
Морфология
Величина
Наименование микробов. Форма палочек Под Споры Характер роема на
анаэробных бактерии мкм ииж среде Кмм-Тароиии
длина ши- Мики и» материала МОСТ!. Форма и располо-
рина жение
Возбудитель шумя- 2-8 0,5- Спорообразуюшая + Овальная, цент- Через 16—20 ч сла-
щего карбункула 1.0 полиморфная (вере- ральное или суб- бое равномерное
С1. СЪаи\чзс1 тенообразная. ша- конневое помутнение, газооб-
ровидная. грушевид- разование
ная), толстая с за-
кругленными коп-
нами палочка, рас-
иолагающаяся оди-
ночно и парами
Анаэробные бакте- 8-15 2,5- Отдельные палоч- + Оиальная: цент- Через 16—24 ч рав-
рии группы злокаче- 10 ки с закругленными ральное или суб- номерное помутне-
ственною раневого краями, нередко конпеное: свободно ние с газообразова-
отека: нити, особенно с лежащее ниями. в дальней-
О. м.*р1>сшп поверхности печени шем бульон просвет-
С1. осскпийст ляется и на дне об-
разуется хлопьевид-
ный осадок
Типа А и В 5-10 0.8- Крупная полимор- + Овальная; ненг- Нежный рост со
1.0 фная с закруглен- ральнос или субтер- слабым га «»образо-
ными конпами мннальное ванием, через IX—24ч
палочка бульон просветляет-
ся. на дне хлопье-
видный осадок
С1. ЬЫЫуйсит 2-5 0.5- Тонкие палочки с + Овальная; цент- Обильное равно-
0.8 закругленными кон- ральное или субгер- мерное помутнение
цами; располагаются минатьное (форма с последующим об-
одиночно, парами игольного ушка) разованием осадка
или цепочками без газообразования
С1. регГподеш 4-8 1,0- Толстая палочка со — Овальная; цент- Через 5—6 ч появ-
1.5 слегка закругленны- ральное или субтер- ляется равномерное
ми обрубленными минальное помутнение, бурное
концами. В организме газообразование, че-
животного образует рез 48 ч среда про-
капсулу светляется
С1. мт1е1в 2-4 1.0- Патиморфная па- + Овальная, распо- Интенсивное по-
1.5 лочка с закруглен- лагается к концам мутнение среды и
ными концами. газообразование, в
расположены по 2—3 старых культурах
членика, встречают- дает осадок, кото-
ся цепочки и нити рый тянется в виде
слизистых нитей
О.нрого^спсь 3-7 0,8- Палочки с закруг- + Овальная; цент- Обильный роет с
1.1 ленными концами. ральное или субгер- газообразованием и
быстро образуют минальное неприятным гнилос-
споры тным запахом
Возбудитель столб- 3-10 0,4- Палочки с закруг- + Круглая: конце- Интенсивная муть.
няка 0.8 ленными концами вое в виде барабан- через 48—72 ч насту-
0.1е1аш ной палочки пает просветление
среды. Культура изда-
ст запах жженого
рога
А. В. С. О. Е. Г 2.6- 0.3- Толстая палочка с + Овальная: субтер- Помутнение сре-
(возбудитель ботулиз- 10 0.8 закругленными кон- минальное (»тен- ды. газообразование.
ма) памп нисная ракетка»). культура издает запах
С1. ЬошЬпиш реже центральное прогорклого масла
Т а 6 л к ц а 5
Морфология
Величина
Наименование микробов. Форма палочек Под Споры Характер роема на
анаэробных бактерии мкм ииж среде Кмм-Тароиии
длина ши- Мики и» материала МОСТ!. Форма и располо-
рина жение
Возбудитель шумя- 2-8 0,5- Спорообразуюшая + Овальная, цент- Через 16—20 ч сла-
щего карбункула 1.0 полиморфная (вере- ральное или суб- бое равномерное
С1. СЪаи\чзс1 тенообразная. ша- конневое помутнение, газооб-
ровидная. грушевид- разование
ная), толстая с за-
кругленными коп-
нами палочка, рас-
иолагающаяся оди-
ночно и парами
Анаэробные бакте- 8-15 2,5- Отдельные палоч- + Оиальная: цент- Через 16—24 ч рав-
рии группы злокаче- 10 ки с закругленными ральное или суб- номерное помутне-
ственною раневого краями, нередко конпеное: свободно ние с газообразова-
отека: нити, особенно с лежащее ниями. в дальней-
О. м.*р1>сшп поверхности печени шем бульон просвет-
С1. осскпийст ляется и на дне об-
разуется хлопьевид-
ный осадок
Типа А и В 5-10 0.8- Крупная полимор- + Овальная; ненг- Нежный рост со
1.0 фная с закруглен- ральнос или субтер- слабым га «»образо-
ными конпами мннальное ванием, через IX—24ч
палочка бульон просветляет-
ся. на дне хлопье-
видный осадок
С1. ЬЫЫуйсит 2-5 0.5- Тонкие палочки с + Овальная; цент- Обильное равно-
0.8 закругленными кон- ральное или субгер- мерное помутнение
цами; располагаются минатьное (форма с последующим об-
одиночно, парами игольного ушка) разованием осадка
или цепочками без газообразования
С1. регГподеш 4-8 1,0- Толстая палочка со — Овальная; цент- Через 5—6 ч появ-
1.5 слегка закругленны- ральное или субтер- ляется равномерное
ми обрубленными минальное помутнение, бурное
концами. В организме газообразование, че-
животного образует рез 48 ч среда про-
капсулу светляется
С1. мт1е1в 2-4 1.0- Патиморфная па- + Овальная, распо- Интенсивное по-
1.5 лочка с закруглен- лагается к концам мутнение среды и
ными концами. газообразование, в
расположены по 2—3 старых культурах
членика, встречают- дает осадок, кото-
ся цепочки и нити рый тянется в виде
слизистых нитей
О.нрого^спсь 3-7 0,8- Палочки с закруг- + Овальная; цент- Обильный роет с
1.1 ленными концами. ральное или субгер- газообразованием и
быстро образуют минальное неприятным гнилос-
споры тным запахом
Возбудитель столб- 3-10 0,4- Палочки с закруг- + Круглая: конце- Интенсивная муть.
няка 0.8 ленными концами вое в виде барабан- через 48—72 ч насту-
0.1е1аш ной палочки пает просветление
среды. Культура изда-
ст запах жженого
рога
А. В. С. О. Е. Г 2.6- 0.3- Толстая палочка с + Овальная: субтер- Помутнение сре-
(возбудитель ботулиз- 10 0.8 закругленными кон- минальное (»тен- ды. газообразование.
ма) памп нисная ракетка»). культура издает запах
С1. ЬошЬпиш реже центральное прогорклого масла
ГОСТ 21237-75 С. 26
Продолжение
Морфология
Наименование аи&эробных бак>ерии Величина микробов, мкм Форма палочек Пол в»« Споры Характер роема на среде Ким-Тарчнши
длина ширина Мики И1 материала И ость Форма и расположение
Возбудитель некро-бактериоза Вас!. пссгорЬогит 0.5-1.0 11 ОЛИ морф -пая. нити раздич ной длины, короткие палочки и даже формы кокков Палочки и короткие нити обычно одинаковой толщины, зсрнисто-окрашенные нити Не образуют Интенсивная муть, очень слабое газообразование
Обозначение: «+» — подвижны; «—» — неподвижны.
После тщательного перемешивания полученных разведений культуры из каждой пробирки среду насасывают в стеклянные трубки (длиной 20 см и диаметром 0.75 см), один коней которых закрыт ватой, а другой оттянут. Среду насасывают на уровень не более а/4 длины трубки, после чего оттянутый конец трубки запаивают (при запайке, во избежание разбрызгивания материала, нельзя держать противоположный конец зажатым).
Трубки со средой быстро остужают под струей холодной воды и помещают в термостат с температурой 37 "С. На 2—5 сутки посевы в трубках просматривают и отмечают рост отдельных колоний. Обычно анаэробные бактерии растут в глубоких слоях агара (ниже I см от верхнего края). При наличии газа столбик агара разрывается. В местах нахождения отдельной колонии трубку надпиливают, фламби-руют над пламенем и разламывают. Колонию снимают петлей вместе с агаром и переносят в пробирку со средой Китг-Тароцци.
В случае необходимости изучают культурные и биохимические свойства выделенной чистой культуры.
Для биологической пробы используют исходный материал, а также культуру.
Заражение опытных животных производят тем же материалом, который используют для бактериологических посевов.
При подозрении на эмфизематозный карбункул заражают внутримышечно морскую свинку взвесью в дозе 0,5—1 см', которая погибает через 16 96 ч; при подозрении на злокачественный отек также заражают внутримышечно морскую свинку или мышь взвесью в дозе 1 см5, которая погибает через 12 24 ч после инъекции: при подозрении на брадзот овец заражают подкожно или внутримышечно морскую свинку, которая погибает через I - 2 суток; при подозрении на дизентерию ягнят и энтеро-токсемию овец для внутримышечного заражения используют к рот и ков или морских свинок, которые погибают в течение первых суток: при подозрении на столбняк заражают фильтратом из культуры в дозе 0,5—0,8 см- подкожно белых мышей в области корня хвоста, животные погибают на 3—4 сутки; при подозрении на некробактериоз заражение в дозе 0.5— 1 см3 кроликов и белых мышей производят под кожу в области уха (кролик) или живота (мышь). На месте инъекции, особенно на ухе. появляются некрозы. Животные погибают через 5 10 суток, иногда они выживают.
Исследование на определение ботулизма (токсинообразование) проводят на белых мышах.
Нейтралы мция токсина проншвоботулинической сывороткой
Используемый материал предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:2, выдерживают при комнатной температуре 1 1,5 ч для экстрагирования токсина, затем настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15—20 мин.
Нейтрализация токсина: к 0.5 0,8 см' фильтрата добавляют 0.2 см3 смеси диагностических моновалентных противоботулиинческих сывороток типов Л. в. С, О. Еи А" по 0,04 см' каждого типа. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
Продолжение
Морфология
Наименование аи&эробных бак>ерии Величина микробов, мкм Форма палочек Пол в»« Споры Характер роема на среде Ким-Тарчнши
длина ширина Мики И1 материала И ость Форма и расположение
Возбудитель некро-бактериоза Вас!. пссгорЬогит 0.5-1.0 11 ОЛИ морф -пая. нити раздич ной длины, короткие палочки и даже формы кокков Палочки и короткие нити обычно одинаковой толщины, зсрнисто-окрашенные нити Не образуют Интенсивная муть, очень слабое газообразование
Обозначение: «+» — подвижны; «—» — неподвижны.
После тщательного перемешивания полученных разведений культуры из каждой пробирки среду насасывают в стеклянные трубки (длиной 20 см и диаметром 0.75 см), один коней которых закрыт ватой, а другой оттянут. Среду насасывают на уровень не более а/4 длины трубки, после чего оттянутый конец трубки запаивают (при запайке, во избежание разбрызгивания материала, нельзя держать противоположный конец зажатым).
Трубки со средой быстро остужают под струей холодной воды и помещают в термостат с температурой 37 "С. На 2—5 сутки посевы в трубках просматривают и отмечают рост отдельных колоний. Обычно анаэробные бактерии растут в глубоких слоях агара (ниже I см от верхнего края). При наличии газа столбик агара разрывается. В местах нахождения отдельной колонии трубку надпиливают, фламби-руют над пламенем и разламывают. Колонию снимают петлей вместе с агаром и переносят в пробирку со средой Китг-Тароцци.
В случае необходимости изучают культурные и биохимические свойства выделенной чистой культуры.
Для биологической пробы используют исходный материал, а также культуру.
Заражение опытных животных производят тем же материалом, который используют для бактериологических посевов.
При подозрении на эмфизематозный карбункул заражают внутримышечно морскую свинку взвесью в дозе 0,5—1 см', которая погибает через 16 96 ч; при подозрении на злокачественный отек также заражают внутримышечно морскую свинку или мышь взвесью в дозе 1 см5, которая погибает через 12 24 ч после инъекции: при подозрении на брадзот овец заражают подкожно или внутримышечно морскую свинку, которая погибает через I - 2 суток; при подозрении на дизентерию ягнят и энтеро-токсемию овец для внутримышечного заражения используют к рот и ков или морских свинок, которые погибают в течение первых суток: при подозрении на столбняк заражают фильтратом из культуры в дозе 0,5—0,8 см- подкожно белых мышей в области корня хвоста, животные погибают на 3—4 сутки; при подозрении на некробактериоз заражение в дозе 0.5— 1 см3 кроликов и белых мышей производят под кожу в области уха (кролик) или живота (мышь). На месте инъекции, особенно на ухе. появляются некрозы. Животные погибают через 5 10 суток, иногда они выживают.
Исследование на определение ботулизма (токсинообразование) проводят на белых мышах.
Нейтралы мция токсина проншвоботулинической сывороткой
Используемый материал предварительно растирают в ступке со стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:2, выдерживают при комнатной температуре 1 1,5 ч для экстрагирования токсина, затем настой фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15—20 мин.
Нейтрализация токсина: к 0.5 0,8 см' фильтрата добавляют 0.2 см3 смеси диагностических моновалентных противоботулиинческих сывороток типов Л. в. С, О. Еи А" по 0,04 см' каждого типа. Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
С. II ГОСТ 21237-75
Двум мышам вводят по 0.5—0.8 см1 исследуемого фильтрата или центрифугата виутрнбрюшиино или внутривенно (внутривенно вводят только нентрнфутат). Другим двум мышам вводят смесь фильтрата и сыворотки.
Аналогичное испытание может быть проведено с 6 7 суточной культурой, выращенной на печеночном бульоне.
В этом случае отсасывают пастеровской пипеткой верхний слой культуры, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и далее поступают, как и при испытании настоя.
Если мыши, получившие фильтрат, необработанный противоботулинической сывороткой, погибают. результат биопробы положительный (в мясе имеется токсин). Мыши, которым вводилась смесь фильтрата с сывороткой (контрольные), выживают.
В случае гибели всех четырех мышей следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5. 10, 20 и даже 100 раз.
При обнаружении в испытуемом материале ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.
И НФОРМАЦИОН Н Ы Е ДАН Н Ы Е
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 14.11.75 № 3054
3. ВЗАМЕН ГОСТ 7269-54 в части раздела II
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение Обозначение Обозначение
НТД. на коюрый Номер пупки НТД. на коюрий Номер пункта НТД. на который Номер пункта
дана ссылка дана ссылка дана ссылка
ГОСТ 171-81 11 1 ОСТ 4328-77 2.1 ГОСТ 13739-78 2.1
ГОСТ 195-77 11 ГОСТ 4523-77 2.1 ГОСТ 13805-76 2.1
ГОСТ 245-76 11 ГОСТ 5541-2002 2.1 ГОСТ 16317-87 2.1
ГОСТ 779-55 11 ГОСТ 5556-81 2.1 ГОСТ 17206-% 2.1
ГОСТ 1027-67 11 ГОСТ 5833-75 2.1 ГОСТ 18300-87 2.1
ГОСТ 1341-97 1.2 ГОСТ 5962-67 2.1 ГОСТ 20015-88 2.1
ГОСТ 1770-74 11 ГОСТ 6038-79 2.1 ГОСТ 20729-75 2.1
ГОСТ 1791-67 11 ГОСТ 6253-78 2.1 ГОСТ 20730-75 2.1
ГОСТ 2493-75 11 ГОСТ 6259-75 2.1 ГОСТ 21239-93 2.1
ГОСТ 2874-82 11 ГОСТ 6552-80 2.1 ГОСТ 21241-89 2.1
ГОСТ 3164-78 11 ГОСТ 6672-75 2.1 ГОСТ 22280-76 2.1
ГОСТ 4025—95 11 ГОСТ 6691-77 2.1 ГОСТ 24104-2001 2.1
ГОСТ 4159-79 11 ГОСТ 6709-72 2.1 ГОСТ 25336-82 2.1
ГОСТ 4170-78 11 ГОСТ 9147-80 2.1 ГОСТ 25706-83 2.1
ГОСТ 4198-75 11 ГОСТ 9284-75 2.1 ГОСТ 27068-86 2.1
ГОСТ 4201-79 11 ГОСТ 9412-93 2.1 ОСТ 25-11-38-84 2.1
ГОСТ 4208-72 11 ГОСТ 10354-82 1.2 ТУ 6-09-5169-84 2.1
ГОСТ 4209-77 11 ГОСТ 11293—89 2.1 ТУ 6-09-5170-84 2.1
ГОСТ 4232-74 11 ГОСТ 11773-76 2.1 ТУ 6-09-5484-90 2.1
ГОСТ 4233-77 11 ГОСТ 12026-76 2.1
5. Ограничение срока действия снято но протоколу № 4—93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС4—94)
6. ИЗДАНИЕ с Изменениями № I, 2, утвержденными в октябре 1981 г., январе 1987 г. (ИУС 1—82, 4-87)
Аналогичное испытание может быть проведено с 6 7 суточной культурой, выращенной на печеночном бульоне.
В этом случае отсасывают пастеровской пипеткой верхний слой культуры, фильтруют через ватно-марлевый фильтр и далее поступают, как и при испытании настоя.
Если мыши, получившие фильтрат, необработанный противоботулинической сывороткой, погибают. результат биопробы положительный (в мясе имеется токсин). Мыши, которым вводилась смесь фильтрата с сывороткой (контрольные), выживают.
В случае гибели всех четырех мышей следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5. 10, 20 и даже 100 раз.
При обнаружении в испытуемом материале ботулинического токсина сразу же ставят развернутую реакцию нейтрализации для определения типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками.
И НФОРМАЦИОН Н Ы Е ДАН Н Ы Е
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Государственным агропромышленным комитетом СССР
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета стандартов Совета Министров СССР от 14.11.75 № 3054
3. ВЗАМЕН ГОСТ 7269-54 в части раздела II
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
Обозначение Обозначение Обозначение
НТД. на коюрый Номер пупки НТД. на коюрий Номер пункта НТД. на который Номер пункта
дана ссылка дана ссылка дана ссылка
ГОСТ 171-81 11 1 ОСТ 4328-77 2.1 ГОСТ 13739-78 2.1
ГОСТ 195-77 11 ГОСТ 4523-77 2.1 ГОСТ 13805-76 2.1
ГОСТ 245-76 11 ГОСТ 5541-2002 2.1 ГОСТ 16317-87 2.1
ГОСТ 779-55 11 ГОСТ 5556-81 2.1 ГОСТ 17206-% 2.1
ГОСТ 1027-67 11 ГОСТ 5833-75 2.1 ГОСТ 18300-87 2.1
ГОСТ 1341-97 1.2 ГОСТ 5962-67 2.1 ГОСТ 20015-88 2.1
ГОСТ 1770-74 11 ГОСТ 6038-79 2.1 ГОСТ 20729-75 2.1
ГОСТ 1791-67 11 ГОСТ 6253-78 2.1 ГОСТ 20730-75 2.1
ГОСТ 2493-75 11 ГОСТ 6259-75 2.1 ГОСТ 21239-93 2.1
ГОСТ 2874-82 11 ГОСТ 6552-80 2.1 ГОСТ 21241-89 2.1
ГОСТ 3164-78 11 ГОСТ 6672-75 2.1 ГОСТ 22280-76 2.1
ГОСТ 4025—95 11 ГОСТ 6691-77 2.1 ГОСТ 24104-2001 2.1
ГОСТ 4159-79 11 ГОСТ 6709-72 2.1 ГОСТ 25336-82 2.1
ГОСТ 4170-78 11 ГОСТ 9147-80 2.1 ГОСТ 25706-83 2.1
ГОСТ 4198-75 11 ГОСТ 9284-75 2.1 ГОСТ 27068-86 2.1
ГОСТ 4201-79 11 ГОСТ 9412-93 2.1 ОСТ 25-11-38-84 2.1
ГОСТ 4208-72 11 ГОСТ 10354-82 1.2 ТУ 6-09-5169-84 2.1
ГОСТ 4209-77 11 ГОСТ 11293—89 2.1 ТУ 6-09-5170-84 2.1
ГОСТ 4232-74 11 ГОСТ 11773-76 2.1 ТУ 6-09-5484-90 2.1
ГОСТ 4233-77 11 ГОСТ 12026-76 2.1
5. Ограничение срока действия снято но протоколу № 4—93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС4—94)
6. ИЗДАНИЕ с Изменениями № I, 2, утвержденными в октябре 1981 г., январе 1987 г. (ИУС 1—82, 4-87)
Комментарии