Дата введения 2000—01—01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения глюконо-5-лактона.
2 Нормативные ссылки
ГОСТ 9793—74 Продукты мясные. Методы определения влаги
ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб
3 Определение
Массовая доля глюкона-с1-лактона — массовая доля глюконо-б-лактона, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.
4 Сущность метода
Глюконо-5-лактон экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют, затем проводят гидролиз глкжоно-й-дактона. содержащегося в фильтрате, гидроксида калия с образованием глюконата.
Преобразуют глюконат в 6-фосфоглюконат в ходе реакции с аленозин-5-трифосфатом (АТФ) в присутствии глюконаткиназы (ГК):
ГК
глюконат + АТФ.....> 6-фосфоглюкоиат + АДФ.
Восстанавливают 6-фосфоглюконатом эквивалентное количество никотинамндаденипдинук-леотидфосфата (НАДФ) в присутствии 6-фосфоглюконатдешдрогеназы (6-ФГДГ):
6-ФГДГ
6-фосфоглюконат + НАДФ'......> НАДФН + СО, + Н* + рнбулозо-5-фосфат.
Измеряют массовую долю образовавшейся восстановленной формы никотинамидаленинди-нуклеотидфосфата (НАДФН) на спектрофотометре при длине волны 365 нм.
5 Реактивы
Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2). должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тшателыю вымытой и пропаренной или стерилизованной.
Вола, используемая для приготовлении растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.
Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.
Примечание — Однократно дистиллированная вода можег содержать ноны металле!), которые снижают активность ферментов, а леминералиюнанная воаа может содержать микроорганизмы, увеличивающие нсспсинфичсскую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анаши.
Препарат НАДФ должен содержать не менее 90 % основного вещества.
Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия их качества требованиям настоящего стандарта.
5.1 Раствор хлорной кислоты с (НСЮ4) ■ 0,4 моль/дм'
17,3 см' раствора хлорной кислоты массовой доли 70 % и плотности 1,67 г/см5 помещают в мерную колбу вместимостью 500 см* и доводят объем раствора ло метки водой.
Примечание — При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемого дли осаждения белков.
5.2 Раствор гмлроксила калия с (КОН) = 2 моль/дм*
Растворяют 56,1 г гидрокенда казня в воде, доводят объем раствора ло 500 см'.
5.3 Буферный раствор активной кислотности 8,0 рН
Растворяют 2.64 г глиннлглицина (С,Н,Г"^0,) и 0,284 г хлорида магния гексагидрата (М&С1, 6Н.О) в 150 см-' волы. Устанавливают активную кислотность раствора 8.0 рН при 20 "С раствором гидрокенда калия (5.2), используя для измерений рН-метр. Доводят объем раствора до 200 см'.
Раствор устойчив не менее I мес при температуре 4 *С.
5.4 Раствор НАДФ
Растворяют 50 мг линатриевой соли никотинамидшенинлинуктеотидфосфориой кислоты (НЛДФ-№:) в 5.0 см1 воды.
Раствор устойчив не менее I мес при температуре 4 "С.
5.5 Раствор аденознн-5-трнфосфата (АТФ)
Растворяют 250 мг динатриевой соли адено1ИН-5-трифосфорноЙ кислоты (ЛТФ-№:) и 250 мг гидрокарбоната натрия (\аНСОл) в 5,0 см' воды.
Раствор устойчив не менее I мес при температуре 4 *С.
5.6 Суспензия 6-ФГДГ
Используют поставляемую в готовом виде суспензию 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из дрожжей, содержащую 6-ФГДГ концентрации 2.0 мг/см' и удельной активности не менее 220 Е/см1, а также глюконаткиназу и НАДФН-оксидазу массовых долей не более 0,05 % каждого.
Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 "С.
5.7 Суспензия ГК
Используют поставляемую в готовом виде суспензию глюконаткиназы из Е.соН, содержащую ГК концентрации 1.0 мг/см' и удельной активности не менее 26 Е/см1 и НАДФН массовой доли не более 0,05 %.
Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 *С.
6 Средства контроля и вспомогательные устройства
Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1—6.11.
6.1 Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.
6.2 Миксер лабораторный.
6.3 Центрифуга лабораторная с пробирками номинальной вместимостью 50 или 100 см'.
6.4 Мономер или рН-метр диапазоном измерений 1 — 14 рН и допускаемой погрешностью ±0.05 рН.
6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.
6.6 Колбы мерные вместимостью 100. 200 и 250 см' и допускаемой относительной погрешностью ±0,2%.
6.7 Дозаторы пнпегочные объемами доз 25 и 100 см' н относительной погрешностью дозирования 1 I %.
6.8 Пипетки градуированные вместимостью 0.01: 0.05: 0.1; 0.5 и 2.5 см' и допускаемой относительной погрешностью 1 I %.
6.9 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
6.10 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал — не более 10 им; интервал измерений оптической плотности — от 0,000 до 2,000: погрешность установки длины волны — ± 3 им; среднее квадратическос отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0,15 %.
6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.
6.12 Весы лабораторные обшего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью ± 0,001 г.
7 Порядок подготовки к проведению измерения
7.1 Отбор проб - по ГОСТ Р 51447.
7.2 Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.
8 Порядок проведения измерений
8.1 Подготовка пробы к проведению измерений
Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.
Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху, герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.
8.2 Навеска для проведения анализа
Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помешают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).
8.3 Приготовление экстракта
8.3.1 К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см' охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.
8.3.2 Часть гомогенизата помешают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин-1, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см'. Первые 10 см' фильтра!а выбрасывают.
8.3.3 50 см' под готовте иного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см' и доводят активную кислотность раствора до 10 рН раствором гидроксила калия (5.2).
8.3.4 Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см' и доводят объем раствора до метки водой.
8.3.5 Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см' фильтрата.
8.3.6 25 см* фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см1 и доводят объем фильтрата до метки водой.
8.4 Определение
8.4.1 Для проведения ферментативной реакции берут дне фотометрические кюветы (611), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:
- 2.50 см буферного раствора (5.3);
- 0,Ш см1 раствора НАДФ (5.4);
- 0Л0 см1 раствора АТФ (5.5).
Затем в одну кювету вносят 0,20 см3 экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую — 0,20 см^ воды, получая контрольный раствор.
В каждую кювету вносят по 0,05 сь^ суспензии 6-ФГДГ (5.6) и тщательно перемешивают содержимое пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).
Содержимое кювет выдерживают 5 мин при комнатной температуре, после чего измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 365 им: А1 — оптическая плотность исследуемого раствора, < 2-%х|%'' ;■ 100 100°00*~ПНГ> 100 _ А-и'ЧиКХД>,ХА*0.2х]0<)0* 1(Ю0Х V * 50 Х т
где Д А = (Аг ~ Ах) - (А21 - -41Ь); 196,1 — молярная масса О — (+)-глюкоиовой кислоты;
А/ — массовая доля влаги в пробе, определенная в соответствии с ГОСТ 9793; т — масса навески (8.2), г;
к — микромолярный коэффициент-оптической плотности НАДФН (й = 3,5 см2/мкмоль при
длине волны 365 им и к = 6.23 см:/мкмоль при длине волны 340 им); V — объем фильтрата, взятий на определение (8.3.6), см\
За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2. Результат определяют с точностью 0,01 %.
9.2 Сходимость
Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать Ю % среднеарифметического значения.
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает метод определения глюконо-5-лактона.
2 Нормативные ссылки
ГОСТ 9793—74 Продукты мясные. Методы определения влаги
ГОСТ Р 51447-99 (ИСО 3100-1-91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб
3 Определение
Массовая доля глюкона-с1-лактона — массовая доля глюконо-б-лактона, определенная в соответствии с настоящим стандартом и выраженная в процентах.
4 Сущность метода
Глюконо-5-лактон экстрагируют из пробы продукта, взятой на испытание, ледяным раствором хлорной кислоты. Смесь центрифугируют, фильтруют, затем проводят гидролиз глкжоно-й-дактона. содержащегося в фильтрате, гидроксида калия с образованием глюконата.
Преобразуют глюконат в 6-фосфоглюконат в ходе реакции с аленозин-5-трифосфатом (АТФ) в присутствии глюконаткиназы (ГК):
ГК
глюконат + АТФ.....> 6-фосфоглюкоиат + АДФ.
Восстанавливают 6-фосфоглюконатом эквивалентное количество никотинамндаденипдинук-леотидфосфата (НАДФ) в присутствии 6-фосфоглюконатдешдрогеназы (6-ФГДГ):
6-ФГДГ
6-фосфоглюконат + НАДФ'......> НАДФН + СО, + Н* + рнбулозо-5-фосфат.
Измеряют массовую долю образовавшейся восстановленной формы никотинамидаленинди-нуклеотидфосфата (НАДФН) на спектрофотометре при длине волны 365 нм.
5 Реактивы
Все реактивы должны быть аналитического качества (не ниже х.ч.). Все растворы, кроме растворов неорганических соединений (5.1 и 5.2). должны храниться в закрытой посуде из темного стекла, тшателыю вымытой и пропаренной или стерилизованной.
Вола, используемая для приготовлении растворов ферментов, должна быть деминерализованной или бидистиллированной, полученной в стеклянном дистилляторе.
Вода, используемая для приготовления растворов химических реагентов и подготовки проб, должна быть дистиллированной или деминерализованной.
Примечание — Однократно дистиллированная вода можег содержать ноны металле!), которые снижают активность ферментов, а леминералиюнанная воаа может содержать микроорганизмы, увеличивающие нсспсинфичсскую фоновую ферментативную активность и искажающие результаты анаши.
Препарат НАДФ должен содержать не менее 90 % основного вещества.
Допускается использовать имеющиеся в продаже готовые наборы реактивов при условии соответствия их качества требованиям настоящего стандарта.
5.1 Раствор хлорной кислоты с (НСЮ4) ■ 0,4 моль/дм'
17,3 см' раствора хлорной кислоты массовой доли 70 % и плотности 1,67 г/см5 помещают в мерную колбу вместимостью 500 см* и доводят объем раствора ло метки водой.
Примечание — При использовании хлорной кислоты меньшей массовой доли проводят перерасчет объема кислоты, используемого дли осаждения белков.
5.2 Раствор гмлроксила калия с (КОН) = 2 моль/дм*
Растворяют 56,1 г гидрокенда казня в воде, доводят объем раствора ло 500 см'.
5.3 Буферный раствор активной кислотности 8,0 рН
Растворяют 2.64 г глиннлглицина (С,Н,Г"^0,) и 0,284 г хлорида магния гексагидрата (М&С1, 6Н.О) в 150 см-' волы. Устанавливают активную кислотность раствора 8.0 рН при 20 "С раствором гидрокенда калия (5.2), используя для измерений рН-метр. Доводят объем раствора до 200 см'.
Раствор устойчив не менее I мес при температуре 4 *С.
5.4 Раствор НАДФ
Растворяют 50 мг линатриевой соли никотинамидшенинлинуктеотидфосфориой кислоты (НЛДФ-№:) в 5.0 см1 воды.
Раствор устойчив не менее I мес при температуре 4 "С.
5.5 Раствор аденознн-5-трнфосфата (АТФ)
Растворяют 250 мг динатриевой соли адено1ИН-5-трифосфорноЙ кислоты (ЛТФ-№:) и 250 мг гидрокарбоната натрия (\аНСОл) в 5,0 см' воды.
Раствор устойчив не менее I мес при температуре 4 *С.
5.6 Суспензия 6-ФГДГ
Используют поставляемую в готовом виде суспензию 6-фосфоглюконатдегидрогеназы из дрожжей, содержащую 6-ФГДГ концентрации 2.0 мг/см' и удельной активности не менее 220 Е/см1, а также глюконаткиназу и НАДФН-оксидазу массовых долей не более 0,05 % каждого.
Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 "С.
5.7 Суспензия ГК
Используют поставляемую в готовом виде суспензию глюконаткиназы из Е.соН, содержащую ГК концентрации 1.0 мг/см' и удельной активности не менее 26 Е/см1 и НАДФН массовой доли не более 0,05 %.
Суспензия устойчива не менее 6 мес при температуре 4 *С.
6 Средства контроля и вспомогательные устройства
Обычная лабораторная аппаратура, а также указанная в 6.1—6.11.
6.1 Мясорубка механическая лабораторная, снабженная перфорированной пластинкой с отверстиями диаметром не более 4 мм.
6.2 Миксер лабораторный.
6.3 Центрифуга лабораторная с пробирками номинальной вместимостью 50 или 100 см'.
6.4 Мономер или рН-метр диапазоном измерений 1 — 14 рН и допускаемой погрешностью ±0.05 рН.
6.5 Фильтры бумажные гофрированные диаметром 15 см.
6.6 Колбы мерные вместимостью 100. 200 и 250 см' и допускаемой относительной погрешностью ±0,2%.
6.7 Дозаторы пнпегочные объемами доз 25 и 100 см' н относительной погрешностью дозирования 1 I %.
6.8 Пипетки градуированные вместимостью 0.01: 0.05: 0.1; 0.5 и 2.5 см' и допускаемой относительной погрешностью 1 I %.
6.9 Шпатели пластиковые или палочки стеклянные для перемешивания содержимого кюветы при проведении фотометрических измерений.
6.10 Спектрофотометр (фотометр) со следующими техническими характеристиками: спектральный интервал — не более 10 им; интервал измерений оптической плотности — от 0,000 до 2,000: погрешность установки длины волны — ± 3 им; среднее квадратическос отклонение случайной составляющей погрешности измерений — не более 0,15 %.
6.11 Кюветы фотометрические толщиной поглощающего слоя 10 мм.
6.12 Весы лабораторные обшего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допускаемой погрешностью ± 0,001 г.
7 Порядок подготовки к проведению измерения
7.1 Отбор проб - по ГОСТ Р 51447.
7.2 Пробу массой не менее 200 г, полученную из репрезентативной выборки, хранят в условиях, предотвращающих порчу и изменение состава.
8 Порядок проведения измерений
8.1 Подготовка пробы к проведению измерений
Образец пробы гомогенизируют, дважды пропуская через мясорубку (6.1) и тщательно перемешивая.
Образец хранят не более 24 ч в заполненном доверху, герметически закрытом контейнере таким образом, чтобы предотвратить порчу или изменение состава.
8.2 Навеска для проведения анализа
Взвешивают приблизительно 50 г исследуемого образца с точностью до 10 мг и помешают навеску образца в лабораторный миксер (6.2).
8.3 Приготовление экстракта
8.3.1 К навеске образца в лабораторном миксере добавляют 100 см' охлажденного льдом раствора хлорной кислоты (5.1) и гомогенизируют.
8.3.2 Часть гомогенизата помешают в центрифужную пробирку и центрифугируют 10 мин при угловой скорости 3000 мин-1, затем, осторожно отодвинув слой жира, отфильтровывают супернатант через гофрированный бумажный фильтр (6.5) в коническую колбу вместимостью 200 см'. Первые 10 см' фильтра!а выбрасывают.
8.3.3 50 см' под готовте иного раствора, который может быть слегка мутным, переносят в стаканчик вместимостью 100 см' и доводят активную кислотность раствора до 10 рН раствором гидроксила калия (5.2).
8.3.4 Количественно переносят содержимое стаканчика в мерную колбу вместимостью 100 см' и доводят объем раствора до метки водой.
8.3.5 Раствор охлаждают в ледяной бане 20 мин и фильтруют через гофрированный бумажный фильтр (6.5), отбросив первые 10 см' фильтрата.
8.3.6 25 см* фильтрата переносят в мерную колбу вместимостью 250 см1 и доводят объем фильтрата до метки водой.
8.4 Определение
8.4.1 Для проведения ферментативной реакции берут дне фотометрические кюветы (611), в каждую из которых пипеточным дозатором (6.5) добавляют:
- 2.50 см буферного раствора (5.3);
- 0,Ш см1 раствора НАДФ (5.4);
- 0Л0 см1 раствора АТФ (5.5).
Затем в одну кювету вносят 0,20 см3 экстракта (8.3.6), получая исследуемый раствор, а во вторую — 0,20 см^ воды, получая контрольный раствор.
В каждую кювету вносят по 0,05 сь^ суспензии 6-ФГДГ (5.6) и тщательно перемешивают содержимое пластиковыми шпателями или стеклянными палочками (6.9).
Содержимое кювет выдерживают 5 мин при комнатной температуре, после чего измеряют оптические плотности относительно воздуха при длине волны 365 им: А1 — оптическая плотность исследуемого раствора, < 2-%х|%'' ;■ 100 100°00*~ПНГ> 100 _ А-и'ЧиКХД>,ХА*0.2х]0<)0* 1(Ю0Х V * 50 Х т
где Д А = (Аг ~ Ах) - (А21 - -41Ь); 196,1 — молярная масса О — (+)-глюкоиовой кислоты;
А/ — массовая доля влаги в пробе, определенная в соответствии с ГОСТ 9793; т — масса навески (8.2), г;
к — микромолярный коэффициент-оптической плотности НАДФН (й = 3,5 см2/мкмоль при
длине волны 365 им и к = 6.23 см:/мкмоль при длине волны 340 им); V — объем фильтрата, взятий на определение (8.3.6), см\
За результат измерений принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений при условии выполнения 9.2. Результат определяют с точностью 0,01 %.
9.2 Сходимость
Относительное расхождение результатов двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, не должно превышать Ю % среднеарифметического значения.
Комментарии