ГОСТ Р 53220-2008: Мясо и мясные продукты. Определение массовой доли растительного (соевого) белка методом электрофореза
Дата введения — 2010—01 — 01
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясные продукты (кромо консервов), полуфабрикаты и устанавливает метод электрофореза для определения в них массовой доли соевого белка.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте испопьзованы нормативные ссылки на следующие стандарты: ГОСТ Р 50444—92 Приборы, аппараты и оборудование медицинские. Общие технические условия
ГОСТ Р 51447—99 (ИСО 3100-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб ГОСТ Р 51652—2000 Спиртэтиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника дпя защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 61—75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 1770—74 (ИС01042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 6259—75 Реактивы. Глицерин. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 24104—2001 Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 25011—81 Мясо и мясные продукты. Методы определения белка
ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29169—91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
3 Сущность метода
Метод основам на тепловой денатурации и экстракции белков из мясных фаршей, состоящих из смесей животных и растительных белков, с последующим электрофоретическим разделением экстрагированных белковых фракций в полиакриламидном геле. Массовая доля соевых белков в смеси определяется по сумме площадей пиков, соответствующих на денситограмме белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000. которая пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.
4 Диапазоны измерений и метрологические характеристики метода
4.1 Диапазон измерения массовой доли соевого белка от 1 % до 85 %.
4.2 Метрологические характеристики метода
Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности Р = 0.95 приведены в таблице 1.
Таблица 1
Наименование показателя Диапазон измерений массовой доли. % Границы относительной погрешности £ 6, % Предел повторяемости 'от- * Относительное среднеквадратичное отклонение воспроизводимости Я01и. %
Массовая доля соевого белка.% От 1 до 85 включ. 30 25 14
Примечание — Нижний предел обнаружения белков растительного происхождения методом электрофореза (денситометрироаания по маркерному белку) — 10 мкг в внализируемой пробе или 1 % от массы анализируемого образца. При содержании растительного белка менее 1 % от массы анализируемого образца возможно интерферирование результата из-за примесей бепков иной природы в ходе электрофоретической идентификации.
5 Отбор проб
5.1 Отбор проб —по ГОСТ Р 51447.
5.2 От представительной пробы отбирают пробу массой не менее 200 г.
Пробу измепьчают на микроизмельчителе тканей и сохраняют в холодильнике при температуре от 0 вС до 5 аС до полного завершения испытания в течение суток.
Допускается хранение проб при температуре от минус 20 "С до минус 10 °С в герметичной упаковке в течение одной недели с даты отбора проб на исследование.
6 Аппаратура, материалы и реактивы
Камера для проведения вертикального электрофореза с источником питания (стабилизация по току и напряжению, максимально 250 В и 500 мА. цифровая индикация: выход на одну электрофорети-ческую камеру).
Денситометрическое устройство для сканирования гелей или хроматограмм типа «ЗупСепе» (Великобритания), позволяющее определять ппощадь одной электрофоретической полосы 0.1 мкг бел-ка в полиакриламидном геле толщиной 1 мм. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,1 мг.
Микроизмельчитель тканей РТ-2 по [1].
рН-метр. позволяющий производить измерения с допускаемой погрешностью ¿0.05 единицы рН. Дозатор пипеточный переменного объема по ГОСТ Р 50444 и по [2]. Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147. Микрошприц вместимостью 100 мкл.
Пипетки 2-го класса точности вместимостью 1.5 и 10 см3 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169.
Воронки стеклянные ВД-1-100 ХС по ГОСТ 25336.
Бутыли стеклянные для растворов по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2-25-2.2-50-2.2-100-2.2-1000-2.2-2000-2 по ГОСТ 1770.
Пластиковые пробирки с крышкой типа «Эппендорф» вместимостью 1 или 2 см3.
Стаканы химические В-1-50. В-1-100. В-1-250, В-1-1000 по ГОСТ 25336.
Цилиндры 2-25,2-100,2-1000 по ГОСТ 1770.
Баня водяная.
Кислота соляная, стандарт-титр 0,1 моль/дм3 по [3].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., с массовой долей основного вещества 35 %—38 %.
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.
Кислота трихпоруксусная, ч.. по [4].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Глицерин по ГОСТ 6259.
N. N. М.М-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99 % по [5].
Акриламид для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99 % по [5]. N. М-метиленбисакриламид (МБА) для электрофореза по{5].
2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (ТРИС) для электрофореза с массовой долей основного вещества 99.9 % по [5].
Натрия д од еци л сульфат (СДС) с массовой долей основного вещества не менее 99 % по [5). Аммония персульфат (АПС) с массовой долей основюго вещества 98 % по [5]. Краситель Кумасси Р*-250 по [5]. Глицин по (5).
2-меркаптоэтанол с содержанием основного вещества не менее 99 % по [5]. Краситель бромфеноловый синий по [5].
Набор маркерных бепков с молекулярной массой 27000—180000 по [5]. Свинина, говядина или баранина с содержанием белка не менее 18 %. Соевый изолят, содержащий не менее 85 % белка по [5].
Допускается применять другие средства измерений, оборудование и материапы с метрологическими и техническими характеристиками не хуже указанных.
7 Подготовка к выполнению измерений 7.1 Приготовление растворов
7.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 количественно переносят содержимое вскрытой ампулы со стандарт-титром соляной кислоты 0,1 моль/дм3, дополнительно ополаскивают ампулу дистиллированной водой, переносят в колбу и доводят дистиллированной водой объем раствора до метки.
7.1.2 Приготовление раствора ТРИС-буфера рН 6,8 для солюбилизации белков
7.1.2.1 Приготовление раствора 2-амино-2(гидроксиметил)-1.3-пропандиола (ТРИС) молярной концентрации 0,1 моль/дм3
Навеску 2-амино-2(гидроксиметил>-1,3-пропандиола (ТРИС) массой 1,211 г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.2.2 В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают 25 см3 раствора ТРИС молярной концентрации 0.1 моль/дм3, добавляют 22,5 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм3 и доводят дистиллированной водой до метки. 7.1.3 Приготовление растворов для электрофореза
7.1.3.1 Приготовление раствора А
Навеску акриламида массой 30 г и навеску N. М'-метиленбисакриламида (МБА) массой 0.15 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.2 Приготовление раствора В
Навеску ТРИС массой 18.2 г и навеску додецилсульфата натрия (СДС) массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН = 8.8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.3 Приготовление раствора С
Навеску ТРИС массой 9,1 г и навеску СДС массой 0.4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН = 6,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.4 Приготовление раствора О
Навеску аммония персульфата (АПС) массой 0.125 г растворяют в 1,23 см3 дистиллированной
воды.
7.1.3.5 Приготовление раствора Е
Навеску акриламида массой 30.0 г и навеску МБА массой 0,8 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в 50—60 см3 дистиллированной воды и доводят дистиллированной водой до метки.
7.1.4 Приготовление электродного буфера 1:4
7.1.4.1 Приготовление 20 %-ного раствора СДС
Навеску СДС массой 20,0 г смешивают в химическом стакане с 80 см3 дистиллированной воды до полного растворения соли.
7.1.4.2 В мерную колбу вместимостью 2 дм3 помещают навеску 24,0 г ТРИС и навеску 115.0 г глицина, добавляют 40 см3 20 %-ного раствора СДС, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения компонентов.
7.1.5 Приготовление окрашивающего раствора для геля
К навеске красителя Кумасси Р-250 массой 1,1 г приливают 200 см3 этилового спирта, 50 см3 уксусной кислоты, 200 см3 дистиллированной воды и перемешивают в химическом стакане до попного растворения.
7.1.6 Приготовление обесцвечивающего раствора
К 500 см3 этилового спирта приливают 350 см3 уксусной кислоты и 2 дм3 дистиллированной воды.
7.1.7 Приготовление буфера для растворения белковых проб
7.1.7.1 Приготовление 0,05 %-ного раствора бромфенолового синего
Навеску 0,05 г бромфенолового синего смешивают в химическом стакане с 99.95 см3 дистиллированной воды.
7.1.7.2 К 0.4 см3 2-меркаптоэтанопа поочередно приливают 0.8 см3 20 %-ного раствора СДС. 0,4 см3 ТРИС-буфера, 0.8 см3 0,05 %-ного раствора бромфенолового синего. 5 см3 дистиллированной воды и 5 см3 глицерина.
Растворы используют свежеприготовпенные. допускается их хранение при температуре 4 вС не более двух суток.
7.1.8 Приготовление раствора маркерных белков с молекулярной массой 27000—180000 с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл
В ппастиковой пробирке типа «Эппендорф» растворяют навеску массой 50.0 мкг готовой смеси маркерных белков с молекулярной массой 27000—180000 в 50.0 мкл буфера для растворения белковых проб. Раствор сохраняют при минус 20 "С в течение одной недели.
7.1.9 Приготовление фиксирующего раствора
Навеску 12.5 г трихлоруксусной кислоты растворяют в химическом стакане в 87.5 см3 дистиллированной воды и попучают 12,5 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
7.1.10 Приготовление растворов для получения полимерного геля
7.1.10.1 Приготовление раствора для нижнего сепарирующего геля
18.0 см3 раствора А. 7,5 см3 раствора В. 4,3 см3 дистиллированной воды, 0,01 см3 ТЕМЕД, 0.2 см3 раствора й смешивают в химическом стакане непосредственно перед использованием.
7.1.10.2 Приготовление раствора для верхнего формирующего геля
В химическом стакане смешивают 1.3 см3 раствора Е. 2,5 см3 раствора С. 6.2 см3 дистиллированной воды. 0.01 см3 ТЕМЕД. 0,1 см3 раствора О.
Растворы используют немедленно поспе приготовпения. 7.2 Проведение экстракции
Навеску образца, содержащегооколо0.2гобщего белка, определенного предварительно методом Кьельдаля по ГОСТ 25011 (для мясных продуктов при массовой доле общего белка 18 % масса навески составляет 1.0 г), гомогенизируют в микроизмельчителе или путем растирания в ступке с 10 см3 ТРИС-буфера рН 6.8 или буфера для растворения белковых проб (в случае плохой растворимости). Затем нагревают смесь до 75 °С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Прозрачную надосадочную жидкость используют для проведения электрофореза.
7.3 Приготовление смесей для градуировочного графика
Навески по 100,0 г свинины (говядины или баранины, содержание животного белка не менее 18%) смешивают с навесками 1,5,10.15.20,50 и 85 г соевого изолята. содержащего не менее 85 % растительного белка.
Точное содержание растительного и животного белка предварительно устанавливают методом Кьельдаля по ГОСТ 25011. Каждую смесь перемешивают на микроизмельчителе тканей в течение 30 мин до образования гомогенной массы. Допускается использование уменьшенных навесок в случае приготовления смеси путем растирания в ступке. Попучают двухкомпонентные модельные мясорасти-тельные смеси, массовая доля растительного соевого белка в которых относительно массовой доли общего белка равна соответственно 4.5 %; 19,1 %: 32,1 %; 41.5 %. 48.6 %; 70.2 % и 80,0 %.
7.4 Построение градуировочного графика
7.4.1 Проводят денситометрирование выявленных характеристических белковых полос, соответствующих молекулярным массам 65000—75000, и автоматически, испопьзуя показания денситометра, вычиспяют сумму площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000.
Сумма площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000. пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.
Градуировочный график строят по результатам опредепения массовой доли соевых белков в двух-компонентных модельных мясорастительных смесях, приведенным в таблице 2.
График, построенный поданным таблицы 2. представлен в приложении А.
Таблица 2
Сумма площадей пиков на электрофо-реграмме в области молекулярных масс 65000—75000. усл. ед. 0.1 26 75 100 145 175 190 225 255 290
Массовая доля соевых белков в анализируемом образие. % 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
8 Проведение исследования
8.1 Проведение электрофореза
8.1.1 В соответствии с инструкцией по экеппуатации собирают камеру для проведения вертикального электрофореза.
8.1.2 Подготовка кассеты и заполнение ее нижним сепарирующим (рабочим) и верхним формирующим гелем
Два чистых стекла, входящих в комплект камеры для электрофореза, обезжиривают этиловым спиртом. Затем их закрепляют в кассету с заданным расстоянием между стеклами 1 мм. образуя пространство для заливки геля размером 115x115x1 мм. Затем осторожно по краю стекла через наконечник от пипеточного дозатора заливают состав для нижнего сепарирующего гепя на три четверти высоты стекла. В кассету по стенке на поверхность залитого геля приливают дистиллированную воду для полимеризации геля и выравнивания верхнего края его поверхности. После полимеризации граница между гелем и водой должна быть четко видна. Процесс происходит при температуре 20 °С в течение 1 ч. Увеличение времени полимеризации приводит к попучению более плотной сетки геля и возрастанию времени, необходимого для проведения электрофореза.
После полимеризации воду сливают и сверху через пластиковый наконечник от пипеточного дозатора заливают формирующий гель. Гель заливают в кассету на поверхность ранее полученного геля до верхних краев стеклянных пластинок, вставляют в раствор специальную пластмассовую гребенку для формирования в геле углублений, в которые будут вноситься анализируемые образцы, и проводят повторно полимеризацию в течение 20—30 мин. Для достижения лучшего разделения белковых полос кассету с гелем можно выдержать в течение 10 ч при 4 X. После этого гребенку следует удалить.
8.1.3 В соответствии с инструкцией по эксплуатации кассету закрепляют в электрофорезной камере. туда же помещают электроды, спираль для охлаждения буфера и заливают в электродную камеру до краев электродный буфер так. чтобы буферный раствор покрывал верхний фай кассеты с гелем.
После этого в каждое углубление микрошприцем вносят предварительно подготовленные по 7.2 растворы белковых проб в количестве 1—2 мкл, содержащих белок из расчета 10—20 мкг на одно углубление. Допускается максимально вносить в одно углубление 20 мкл раствора белка. Введение проб осуществляют медленно, так. чтобы вводимый раствор белка не всплывал со дна углублений.
В отдельное углубление рядом с анализируемой пробой вносят 5 мкл раствора маркерных белков с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл, приготовленного по 7.1.8.
Включают электрический ток и проводят процесс при плотности постоянного тока 2,5 мА/см2 в течение 1—2 ч.
Время процесса зависит от состояния геля (насколько свежими были использованные растворы), а также от расстояния, на которое необходимо продвинуть белки.
8.1.4 В ходе электрофореза окрашенные в фиолетовый цвет полосы белков собираются на дне углублений верхнего геля, затем продвигаются вниз. Происходит формирование молекул белка под воздействием тока (движение) и распрямление белковых глобул в присутствии СДС — реактива, способствующего разворачиванию молекул белка (добавление 1,5 г СДС на 1 г белка вызывает его полную денатурацию).
При закислении раствора окраска полос может измениться на желтую из-за наличия красителя бромфенолового синего.
После прохождения белков через верхний гель полосы собираются на границе двух гелей, входят в нижний сепарирующий гель, и происходит разделение белка на его составные части (фракции).
Путь, который проходит каждая полоса Я,, прямо пропорционален молекулярной массе белковой фракции.
8.1.5 Процесс завершен, когда нижние низкомолекулярные белковые фракции оказываются примерно в 2 см от нижнего края геля. Камеру отключают от источника тока и электродный буфер сливают. Камеру разбирают и извлекают гель на поверхность стекла. Отделенный гель помещают в 12,5%-ный раствор трихлорухсусной кислоты, выдерживают 15 мин. сливают кислоту и промывают дистиллированной водой. Гель переносят в окрашивающий раствор и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
Затем опять промывают дистиллированной водой 2 раза. Обесцвечивание геля проводят в обесцвечивающем растворе в течение 3 ч.
В результате получают полиакриламидный гель, в котором видны окрашенные в синий цвет полосы фракций анализируемого белка и полосы, соответствующие маркерным белкам с известной молекулярной массой. Сравнение белковых полос анализируемого образца с полосами маркерных белков позволяет сделать заключение о фракционном составе определяемого белка и молекулярной массе каждой фракции, а также выявить характеристические полосы белка, соответствующие примесям растительного происхождения.
8.1.6 Повторяют анализ со второй параллельной пробой.
8.2 Определение массовой доли соевых белков
8.2.1 По градуировочному графику определяют массовую долю соевых белков в анализируемой пробе.
9 Обработка результатов
9.1 За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:
[(2 ■ |С, - С2|У(С, + С2)] 100 £Готм, (1)
гдеС,иС2 — результаты параллельныхопределений массовой доли соевых белков, определенные по градуировочному графику. %: готм — предел повторяемости, приведенный в таблице 1.
Результат вычислений округляют до целого числа. 9.2 Массовую долю растительного соевого белка 6р. %. относительно массовой доли общего белка. вычисляют по формуле:
6р = (СОД-100, (2)
где С — среднеарифметическое значение массовой доли растительных белков в анализируемом образце, %;
бк — значение массовой доли общего белка в анализируемом образце, определенное методом Кьельдаля по ГОСТ 25011, %.
10 Требования безопасности
10.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
10.2 Помещение, в котором проводят измерения, допжно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
10.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясные продукты (кромо консервов), полуфабрикаты и устанавливает метод электрофореза для определения в них массовой доли соевого белка.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте испопьзованы нормативные ссылки на следующие стандарты: ГОСТ Р 50444—92 Приборы, аппараты и оборудование медицинские. Общие технические условия
ГОСТ Р 51447—99 (ИСО 3100-1—91) Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб ГОСТ Р 51652—2000 Спиртэтиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия ГОСТ 12.1.004—91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007—76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019—79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009—83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника дпя защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 61—75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ 1770—74 (ИС01042—83, ИСО 4788—80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры. мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3118—77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия ГОСТ 6259—75 Реактивы. Глицерин. Технические условия ГОСТ 6709—72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9147—80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия ГОСТ 24104—2001 Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 25011—81 Мясо и мясные продукты. Методы определения белка
ГОСТ 25336—82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29169—91 (ИСО 648—77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой ГОСТ 29227—91 (ИСО 835-1—81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
3 Сущность метода
Метод основам на тепловой денатурации и экстракции белков из мясных фаршей, состоящих из смесей животных и растительных белков, с последующим электрофоретическим разделением экстрагированных белковых фракций в полиакриламидном геле. Массовая доля соевых белков в смеси определяется по сумме площадей пиков, соответствующих на денситограмме белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000. которая пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.
4 Диапазоны измерений и метрологические характеристики метода
4.1 Диапазон измерения массовой доли соевого белка от 1 % до 85 %.
4.2 Метрологические характеристики метода
Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности Р = 0.95 приведены в таблице 1.
Таблица 1
Наименование показателя Диапазон измерений массовой доли. % Границы относительной погрешности £ 6, % Предел повторяемости 'от- * Относительное среднеквадратичное отклонение воспроизводимости Я01и. %
Массовая доля соевого белка.% От 1 до 85 включ. 30 25 14
Примечание — Нижний предел обнаружения белков растительного происхождения методом электрофореза (денситометрироаания по маркерному белку) — 10 мкг в внализируемой пробе или 1 % от массы анализируемого образца. При содержании растительного белка менее 1 % от массы анализируемого образца возможно интерферирование результата из-за примесей бепков иной природы в ходе электрофоретической идентификации.
5 Отбор проб
5.1 Отбор проб —по ГОСТ Р 51447.
5.2 От представительной пробы отбирают пробу массой не менее 200 г.
Пробу измепьчают на микроизмельчителе тканей и сохраняют в холодильнике при температуре от 0 вС до 5 аС до полного завершения испытания в течение суток.
Допускается хранение проб при температуре от минус 20 "С до минус 10 °С в герметичной упаковке в течение одной недели с даты отбора проб на исследование.
6 Аппаратура, материалы и реактивы
Камера для проведения вертикального электрофореза с источником питания (стабилизация по току и напряжению, максимально 250 В и 500 мА. цифровая индикация: выход на одну электрофорети-ческую камеру).
Денситометрическое устройство для сканирования гелей или хроматограмм типа «ЗупСепе» (Великобритания), позволяющее определять ппощадь одной электрофоретической полосы 0.1 мкг бел-ка в полиакриламидном геле толщиной 1 мм. Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,1 мг.
Микроизмельчитель тканей РТ-2 по [1].
рН-метр. позволяющий производить измерения с допускаемой погрешностью ¿0.05 единицы рН. Дозатор пипеточный переменного объема по ГОСТ Р 50444 и по [2]. Ступка фарфоровая по ГОСТ 9147. Микрошприц вместимостью 100 мкл.
Пипетки 2-го класса точности вместимостью 1.5 и 10 см3 по ГОСТ 29227 и ГОСТ 29169.
Воронки стеклянные ВД-1-100 ХС по ГОСТ 25336.
Бутыли стеклянные для растворов по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2-25-2.2-50-2.2-100-2.2-1000-2.2-2000-2 по ГОСТ 1770.
Пластиковые пробирки с крышкой типа «Эппендорф» вместимостью 1 или 2 см3.
Стаканы химические В-1-50. В-1-100. В-1-250, В-1-1000 по ГОСТ 25336.
Цилиндры 2-25,2-100,2-1000 по ГОСТ 1770.
Баня водяная.
Кислота соляная, стандарт-титр 0,1 моль/дм3 по [3].
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч., с массовой долей основного вещества 35 %—38 %.
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ Р 51652.
Кислота трихпоруксусная, ч.. по [4].
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Глицерин по ГОСТ 6259.
N. N. М.М-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД) для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99 % по [5].
Акриламид для электрофореза с массовой долей основного вещества не менее 99 % по [5]. N. М-метиленбисакриламид (МБА) для электрофореза по{5].
2-амино-2(гидроксиметил)-1,3-пропандиол (ТРИС) для электрофореза с массовой долей основного вещества 99.9 % по [5].
Натрия д од еци л сульфат (СДС) с массовой долей основного вещества не менее 99 % по [5). Аммония персульфат (АПС) с массовой долей основюго вещества 98 % по [5]. Краситель Кумасси Р*-250 по [5]. Глицин по (5).
2-меркаптоэтанол с содержанием основного вещества не менее 99 % по [5]. Краситель бромфеноловый синий по [5].
Набор маркерных бепков с молекулярной массой 27000—180000 по [5]. Свинина, говядина или баранина с содержанием белка не менее 18 %. Соевый изолят, содержащий не менее 85 % белка по [5].
Допускается применять другие средства измерений, оборудование и материапы с метрологическими и техническими характеристиками не хуже указанных.
7 Подготовка к выполнению измерений 7.1 Приготовление растворов
7.1.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 количественно переносят содержимое вскрытой ампулы со стандарт-титром соляной кислоты 0,1 моль/дм3, дополнительно ополаскивают ампулу дистиллированной водой, переносят в колбу и доводят дистиллированной водой объем раствора до метки.
7.1.2 Приготовление раствора ТРИС-буфера рН 6,8 для солюбилизации белков
7.1.2.1 Приготовление раствора 2-амино-2(гидроксиметил)-1.3-пропандиола (ТРИС) молярной концентрации 0,1 моль/дм3
Навеску 2-амино-2(гидроксиметил>-1,3-пропандиола (ТРИС) массой 1,211 г вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.2.2 В мерную колбу вместимостью 50 см3 помещают 25 см3 раствора ТРИС молярной концентрации 0.1 моль/дм3, добавляют 22,5 см3 раствора соляной кислоты молярной концентрации 0.1 моль/дм3 и доводят дистиллированной водой до метки. 7.1.3 Приготовление растворов для электрофореза
7.1.3.1 Приготовление раствора А
Навеску акриламида массой 30 г и навеску N. М'-метиленбисакриламида (МБА) массой 0.15 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.2 Приготовление раствора В
Навеску ТРИС массой 18.2 г и навеску додецилсульфата натрия (СДС) массой 0,4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН = 8.8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.3 Приготовление раствора С
Навеску ТРИС массой 9,1 г и навеску СДС массой 0.4 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в небольшом количестве дистиллированной воды, устанавливают рН = 6,8 добавлением концентрированной соляной кислоты и доводят объем раствора дистиллированной водой до метки.
7.1.3.4 Приготовление раствора О
Навеску аммония персульфата (АПС) массой 0.125 г растворяют в 1,23 см3 дистиллированной
воды.
7.1.3.5 Приготовление раствора Е
Навеску акриламида массой 30.0 г и навеску МБА массой 0,8 г растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см3 в 50—60 см3 дистиллированной воды и доводят дистиллированной водой до метки.
7.1.4 Приготовление электродного буфера 1:4
7.1.4.1 Приготовление 20 %-ного раствора СДС
Навеску СДС массой 20,0 г смешивают в химическом стакане с 80 см3 дистиллированной воды до полного растворения соли.
7.1.4.2 В мерную колбу вместимостью 2 дм3 помещают навеску 24,0 г ТРИС и навеску 115.0 г глицина, добавляют 40 см3 20 %-ного раствора СДС, доводят объем до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения компонентов.
7.1.5 Приготовление окрашивающего раствора для геля
К навеске красителя Кумасси Р-250 массой 1,1 г приливают 200 см3 этилового спирта, 50 см3 уксусной кислоты, 200 см3 дистиллированной воды и перемешивают в химическом стакане до попного растворения.
7.1.6 Приготовление обесцвечивающего раствора
К 500 см3 этилового спирта приливают 350 см3 уксусной кислоты и 2 дм3 дистиллированной воды.
7.1.7 Приготовление буфера для растворения белковых проб
7.1.7.1 Приготовление 0,05 %-ного раствора бромфенолового синего
Навеску 0,05 г бромфенолового синего смешивают в химическом стакане с 99.95 см3 дистиллированной воды.
7.1.7.2 К 0.4 см3 2-меркаптоэтанопа поочередно приливают 0.8 см3 20 %-ного раствора СДС. 0,4 см3 ТРИС-буфера, 0.8 см3 0,05 %-ного раствора бромфенолового синего. 5 см3 дистиллированной воды и 5 см3 глицерина.
Растворы используют свежеприготовпенные. допускается их хранение при температуре 4 вС не более двух суток.
7.1.8 Приготовление раствора маркерных белков с молекулярной массой 27000—180000 с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл
В ппастиковой пробирке типа «Эппендорф» растворяют навеску массой 50.0 мкг готовой смеси маркерных белков с молекулярной массой 27000—180000 в 50.0 мкл буфера для растворения белковых проб. Раствор сохраняют при минус 20 "С в течение одной недели.
7.1.9 Приготовление фиксирующего раствора
Навеску 12.5 г трихлоруксусной кислоты растворяют в химическом стакане в 87.5 см3 дистиллированной воды и попучают 12,5 %-ный раствор трихлоруксусной кислоты.
7.1.10 Приготовление растворов для получения полимерного геля
7.1.10.1 Приготовление раствора для нижнего сепарирующего геля
18.0 см3 раствора А. 7,5 см3 раствора В. 4,3 см3 дистиллированной воды, 0,01 см3 ТЕМЕД, 0.2 см3 раствора й смешивают в химическом стакане непосредственно перед использованием.
7.1.10.2 Приготовление раствора для верхнего формирующего геля
В химическом стакане смешивают 1.3 см3 раствора Е. 2,5 см3 раствора С. 6.2 см3 дистиллированной воды. 0.01 см3 ТЕМЕД. 0,1 см3 раствора О.
Растворы используют немедленно поспе приготовпения. 7.2 Проведение экстракции
Навеску образца, содержащегооколо0.2гобщего белка, определенного предварительно методом Кьельдаля по ГОСТ 25011 (для мясных продуктов при массовой доле общего белка 18 % масса навески составляет 1.0 г), гомогенизируют в микроизмельчителе или путем растирания в ступке с 10 см3 ТРИС-буфера рН 6.8 или буфера для растворения белковых проб (в случае плохой растворимости). Затем нагревают смесь до 75 °С и выдерживают при этой температуре 30 мин. Смесь центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Прозрачную надосадочную жидкость используют для проведения электрофореза.
7.3 Приготовление смесей для градуировочного графика
Навески по 100,0 г свинины (говядины или баранины, содержание животного белка не менее 18%) смешивают с навесками 1,5,10.15.20,50 и 85 г соевого изолята. содержащего не менее 85 % растительного белка.
Точное содержание растительного и животного белка предварительно устанавливают методом Кьельдаля по ГОСТ 25011. Каждую смесь перемешивают на микроизмельчителе тканей в течение 30 мин до образования гомогенной массы. Допускается использование уменьшенных навесок в случае приготовления смеси путем растирания в ступке. Попучают двухкомпонентные модельные мясорасти-тельные смеси, массовая доля растительного соевого белка в которых относительно массовой доли общего белка равна соответственно 4.5 %; 19,1 %: 32,1 %; 41.5 %. 48.6 %; 70.2 % и 80,0 %.
7.4 Построение градуировочного графика
7.4.1 Проводят денситометрирование выявленных характеристических белковых полос, соответствующих молекулярным массам 65000—75000, и автоматически, испопьзуя показания денситометра, вычиспяют сумму площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000.
Сумма площадей пиков, соответствующих белковым зонам с молекулярными массами 65000—75000. пропорциональна содержанию соевой добавки в мясе и мясных продуктах.
Градуировочный график строят по результатам опредепения массовой доли соевых белков в двух-компонентных модельных мясорастительных смесях, приведенным в таблице 2.
График, построенный поданным таблицы 2. представлен в приложении А.
Таблица 2
Сумма площадей пиков на электрофо-реграмме в области молекулярных масс 65000—75000. усл. ед. 0.1 26 75 100 145 175 190 225 255 290
Массовая доля соевых белков в анализируемом образие. % 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
8 Проведение исследования
8.1 Проведение электрофореза
8.1.1 В соответствии с инструкцией по экеппуатации собирают камеру для проведения вертикального электрофореза.
8.1.2 Подготовка кассеты и заполнение ее нижним сепарирующим (рабочим) и верхним формирующим гелем
Два чистых стекла, входящих в комплект камеры для электрофореза, обезжиривают этиловым спиртом. Затем их закрепляют в кассету с заданным расстоянием между стеклами 1 мм. образуя пространство для заливки геля размером 115x115x1 мм. Затем осторожно по краю стекла через наконечник от пипеточного дозатора заливают состав для нижнего сепарирующего гепя на три четверти высоты стекла. В кассету по стенке на поверхность залитого геля приливают дистиллированную воду для полимеризации геля и выравнивания верхнего края его поверхности. После полимеризации граница между гелем и водой должна быть четко видна. Процесс происходит при температуре 20 °С в течение 1 ч. Увеличение времени полимеризации приводит к попучению более плотной сетки геля и возрастанию времени, необходимого для проведения электрофореза.
После полимеризации воду сливают и сверху через пластиковый наконечник от пипеточного дозатора заливают формирующий гель. Гель заливают в кассету на поверхность ранее полученного геля до верхних краев стеклянных пластинок, вставляют в раствор специальную пластмассовую гребенку для формирования в геле углублений, в которые будут вноситься анализируемые образцы, и проводят повторно полимеризацию в течение 20—30 мин. Для достижения лучшего разделения белковых полос кассету с гелем можно выдержать в течение 10 ч при 4 X. После этого гребенку следует удалить.
8.1.3 В соответствии с инструкцией по эксплуатации кассету закрепляют в электрофорезной камере. туда же помещают электроды, спираль для охлаждения буфера и заливают в электродную камеру до краев электродный буфер так. чтобы буферный раствор покрывал верхний фай кассеты с гелем.
После этого в каждое углубление микрошприцем вносят предварительно подготовленные по 7.2 растворы белковых проб в количестве 1—2 мкл, содержащих белок из расчета 10—20 мкг на одно углубление. Допускается максимально вносить в одно углубление 20 мкл раствора белка. Введение проб осуществляют медленно, так. чтобы вводимый раствор белка не всплывал со дна углублений.
В отдельное углубление рядом с анализируемой пробой вносят 5 мкл раствора маркерных белков с массовой концентрацией белка 1 мкг/мкл, приготовленного по 7.1.8.
Включают электрический ток и проводят процесс при плотности постоянного тока 2,5 мА/см2 в течение 1—2 ч.
Время процесса зависит от состояния геля (насколько свежими были использованные растворы), а также от расстояния, на которое необходимо продвинуть белки.
8.1.4 В ходе электрофореза окрашенные в фиолетовый цвет полосы белков собираются на дне углублений верхнего геля, затем продвигаются вниз. Происходит формирование молекул белка под воздействием тока (движение) и распрямление белковых глобул в присутствии СДС — реактива, способствующего разворачиванию молекул белка (добавление 1,5 г СДС на 1 г белка вызывает его полную денатурацию).
При закислении раствора окраска полос может измениться на желтую из-за наличия красителя бромфенолового синего.
После прохождения белков через верхний гель полосы собираются на границе двух гелей, входят в нижний сепарирующий гель, и происходит разделение белка на его составные части (фракции).
Путь, который проходит каждая полоса Я,, прямо пропорционален молекулярной массе белковой фракции.
8.1.5 Процесс завершен, когда нижние низкомолекулярные белковые фракции оказываются примерно в 2 см от нижнего края геля. Камеру отключают от источника тока и электродный буфер сливают. Камеру разбирают и извлекают гель на поверхность стекла. Отделенный гель помещают в 12,5%-ный раствор трихлорухсусной кислоты, выдерживают 15 мин. сливают кислоту и промывают дистиллированной водой. Гель переносят в окрашивающий раствор и выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин.
Затем опять промывают дистиллированной водой 2 раза. Обесцвечивание геля проводят в обесцвечивающем растворе в течение 3 ч.
В результате получают полиакриламидный гель, в котором видны окрашенные в синий цвет полосы фракций анализируемого белка и полосы, соответствующие маркерным белкам с известной молекулярной массой. Сравнение белковых полос анализируемого образца с полосами маркерных белков позволяет сделать заключение о фракционном составе определяемого белка и молекулярной массе каждой фракции, а также выявить характеристические полосы белка, соответствующие примесям растительного происхождения.
8.1.6 Повторяют анализ со второй параллельной пробой.
8.2 Определение массовой доли соевых белков
8.2.1 По градуировочному графику определяют массовую долю соевых белков в анализируемой пробе.
9 Обработка результатов
9.1 За окончательный результат измерения принимают среднеарифметическое значение двух параллельных определений, если выполняется условие приемлемости:
[(2 ■ |С, - С2|У(С, + С2)] 100 £Готм, (1)
гдеС,иС2 — результаты параллельныхопределений массовой доли соевых белков, определенные по градуировочному графику. %: готм — предел повторяемости, приведенный в таблице 1.
Результат вычислений округляют до целого числа. 9.2 Массовую долю растительного соевого белка 6р. %. относительно массовой доли общего белка. вычисляют по формуле:
6р = (СОД-100, (2)
где С — среднеарифметическое значение массовой доли растительных белков в анализируемом образце, %;
бк — значение массовой доли общего белка в анализируемом образце, определенное методом Кьельдаля по ГОСТ 25011, %.
10 Требования безопасности
10.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
10.2 Помещение, в котором проводят измерения, допжно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
10.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.
Комментарии