Дата введения 01.01.83
Настояший стандарт распространяется на колбасные изделия (фаршированные, пареные, полукопченые. парено-копченые, сырокопченые, ливерные и кровяные колбасы, мясные хлебы, сосиски, сардельки, паштеты, зельцы, студни), продукты из мяса (из свинины, говядины, баранины, из мяса других видов убойного скота и птицы) и устанавливает методы бактериологического анализа: определения общего количества микробов; определения бактерий группы кишечной палочки; определения бактерий из рода сальмонелл; определения бактерий группы протея; определения коагулазоположительиых стафилококков: определения сульфитвосстанашшвающих клострилий.
I. ОТБОР ПРОБ
1.1. Огбор точечных проб для бактериологического анализа проводят по ГОСТ 9792.
1.2. Пробы хранят при температуре 6—8 'С. Анализ проводят не позднее, чем через 4 ч с момента отбора проб.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
2.1. Для проведения бактериологического анализа применяют следующие аппаратуру, материалы и реактивы:
автоклав вертикальный по ТУ 27-31—2939; аппарат Коха;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*:
гомогенизатор бактериологический, смеситель или аппарат для измельчения тканей: микроскоп марок МБИ и МБР или других аналогичных марок; мясорубку бытовую по ГОСТ 4025; потенциометр;
термостат электрический с автоматическим терморегулятором;
термостат или водяную баню с терморегулятором;
холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317;
шкаф сушильный лабораторный:
бумагу парафинированную по ГОСТ 9569;
бумагу фильтровальную лабораторную по ГОС Т 12026;
пату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;
воронки В-36 80 ХС. ВФ-1—75 ХС по ГОСТ 25336,
лупы с увеличением 3' и 5' ;
марлю медицинскую по ГОСТ 9412;
марлю бытовую по ГОСТ II109;
ножницы медицинские по ГОСТ 21239;
петлю бактериологическую;
палочки стеклянные;
пинцеты медицинские по ГОСТ 21241;
пипетки Мора вместимостью 25 и 50 см5;
термометры стеклянные технические по ГОСТ 28498;
пипетки пастеровские;
пипетки 7-1-1; 7-1-2; 7-1-5; 7-1-10; 8-2-0,1 по ГОСТ 29169;
пробирки 112 10-90 ХС; 113-5 ХС по ГОСТ 25336;
скальпель медицинский по ГОСТ 21240;
стаканы В-1-250 ТС; Н-2-100 ТХС по ГОСТ 25336;
колбы К-2—250—34 ТХС; 11-2-250-34 ТХС по ГОСТ 25336;
спиртовка СЛ-1 по ГОСТ 25336;
стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284; стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672; ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147; флаконы Сокслета;
цилиндры 2- 100; 4-100; 4-25 по ГОСТ 1770;
колбы мерные 2-100-2; 2-250-2; 2-1000 2 по ГОСТ 1770;
часы песочные на 1, 2. 5 мин;
чашка ЧЬН-1—40 по ГОСТ 25336;
штативы для пробирок;
агар микробиологический по ГОСТ 17206;
агар Эндо. сухой;
белок яичный;
бриллиантовый зеленый;
воду бромную;
бромкрезолпурпур;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
поду дистиллированную по ГОСТ 6709;
воду мясную по ГОСТ 20729;
ген циан-виолет;
гилролизат рыбный сухой;
глюкозу кристаллическую по ГОСТ 975. х. ч.;
глицерин по ГОСТ 6259. х. ч.;
дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171;
диализат лрожжспой;
железо сернокислое по ГОСТ 4148;
железо хлористое:
желчь крупного рогатого скота;
йод по ГОСТ 4159;
калий йодистый по ГОСТ 4232;
калии фосфорнокислый однозамешенный по ГОСТ 4198. ч. д. а.; калий фосфорнокислый двузамешенный по ГОСТ 2493. ч. д. а. кальций углекислый по ГОСТ 4530; кислоту розоловую;
кислоту соляную по ГОСТ 14261. ос. ч., плотносгью 1.19 г/см'; кристалл-виолет; лактозу, х. ч.; манннт, х. ч.;
магний сернокислый по ГОСТ 4523; магний хлористый по ГОСТ 4209. х. ч.;
масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164;
масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
метиленовый голубой;
мел химический осажденный по ГОСТ 8253;
мочевину по ГОСТ 6691, х. ч.;
набор адсорбированных поливалентных сывороток и монорецепторных агглютинирующих О и Н сальмонелле зных сывороток;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
натрий кислый селенистокислый (без теллура);
натрий сернистокислый безводный по ГОСТ 195;
натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245. ч. д. а.;
натрий фосфорн о кислый двузамешенный безводный по ГОСТ 11773, ч. д. а.;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.;
панкреатин;
парад и метил амидобен зал ьдегид;
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805; песок кварцевый для тонкой керамики по ГОСТ 7031; плазму нитратную сухую (кроличью); сахарозу по ГОСТ 5833. х. ч.;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую (соль Мора) по ГОСТ 4208;
спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*;
среду Вильсон-Блера (сухую);
среду КОДА, сухую питательную;
среду Левина сухую;
среду Плоскнрева сухую;
среду кито-пентоно-дрожжевую. сухую (среду КПД);
среды сухие с углеводами и индикатором *ВР» (среды Гисса);
натрий серноватистокислый по ГОСТ 27068. х. ч.;
фуксин (основной и кислый) для микробиологических целей;
хинозол;
хлороформ по ГОСТ 20015; Д-инклосерин.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
3.1. Окраску препаратов по [ раму проводят по ГОСТ 21237.
3.2. Приготовление физиологического раствора
8.5 г хлористого натрия растворяют в I дм' водопроводной воды. Раствор стерилизуют при давлении 10* Па в течение 20 мин.
3.3. Приготовление пептон пой воды
В 1 дм' дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия. Жидкость подогревают до растворения пепгона, фильтруют, устанавливают рН 7.2—7.4 и стерилизуют при давлении 10* Па в течение 20 мин.
3.4. Приготовление мясо-пептон ного агара (МПА)
В 1 дм5 мясо-пептонного бульона добавляют 20 г агара-агара и кипятят при слабом нагревании, постоянно помешивая до полною растворения агара. Устанавливают рН среды 7,0—7.2.
Охлаждают до температуры 50 - 55 "С и осветляют яичным белком (из расчета белок одного яйца на 1 дм1 мясо-пептонного агара). Помещают агар в автоклав (не завинчивая крышку) или в аппарат Коха на 1 ч. чтобы белок свернулся и. оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий раствор фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Рахчивают во флаконы и пробирки и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при давлении 10' Па.
3.5. Питательная среда может быть приготовлена из сухого питательного агара.
3.6. Приготовление голодного агара
2 г агара-агара растворяют в 100 см1 водопроводной воды. Раствор стерилизуют при давлении 10' Па в течение 20 мин.
3.7. Приготовление бульона Хоттиигера
В 1 дм' кипящей водопроводной воды опускают на 20 мин 1 кг мяса, освобождеиного от костей, жира и сухожилий, нарезанного мелкими кусочками. Затем мясо вынимают, измельчают на мясорубке. снова кладут в тот же отвар. Добавляют 40 г измельченной поджелудочной железы, очищенной от жира и дважды пропущенной через мясорубку (вместо поджелудочной железы можно брать 5 г панкреатина), доливают 20 см1 хлороформа. Бутыль плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают (пробку надо придерживать). Смесь оставляют для переваривания в термостате при 45 "С до 20 сут. Мясо в виде мелкозернистой массы оседает на дно бутыли. Жидкость над мясом должна быть прозрачной. Эту жидкость сливают и стерилизуют при 10' Па в течение 20 мин. Готовый раствор дает положительную реакцию на триптофан с бромной водой.
3.7.1. Приготовление бромной воды
3—3.5 см5 чистого брома растворяют в 100 см' дистиллированной (стерильной) воды.
3.8. Приготовление м я с о-п е п т о и и о г о бульона (МПБ) на основе бульона Хоттингера
Основной раствор Хоттиигера разводят в 5- 10 раз (до соломенного цвета). На I дм1 разведенного бульона берут 10 г пептона и 5 г хлористого натрия. Затем устанавливают рН 7,3—7.4. кипятят 20 мин и фильтруют.
Режим стерилизации 20 мин при давлении 10' Па.
3.9. Приготовление среды Эндо
В 100 см4 расплавленного мясо-пептонного агара добавляют I г лактозы, растворенной в 5 см водопроводной воды, прокипяченной в течение 5 мин. МИЛ охлаждают до температуры 60—70"С и к нему добавляют смесь расгворов основного фуксина и серн истокисл ого натрия. Для приготовления смеси 0,5 г сернистокислого натрия растворяют в 5 см' стерильной воды, кипятят в течение 5 мин добавляют 1 см спиртового раствора 100 г/дм' основного фуксина. После перемешивания среду разливают в чашки Петри. Среда Эндо в чашках должна иметь бледно-розовый цвет.
Среду Эндо готовят в день ее использования.
(Измененная редакция. Нзм. № 2).
3.10. Среда Эндо может быть приготовлена из сухой готовой среды.
3.11. Приготовление среды КОДА (сухая готовая) проводят согласно инструкции, утвержденной в установленном порядке.
3.12. Приготовление среды «ХБ (х и и о зо л- б ро м кре зол-п у р п у р но й)
3.12.1. Для приготовления бром крезол-пурпура 0,8 г порошка заливают 50 см* этилового ректификованного спирта. Через день раствор готов к употреблению.
Раствором можно пользоваться в течение месяца со дня приготовления.
Для приготовления хинозола 0,1 г порошка растворяют в 100 см1 стерильной дистиллированной воды. При хранении свойства его не изменяются. Срок хранения не ограничен.
Краски хранить в темном месте при комнатной температуре.
3.12.2. Приготовление дрожжевого автализата
В 600 см1 стерильной воды растворяют 1 г однозамещеиного фосфорнокислого калия и 0.1 г сернокислого магния, затем добавляют 100 г прессованных хлебных дрожжей и взбалтывают до получения суспензии. В колбу с суспензией наливают N 10 см хлороформа, закрывают ватной пробкой и накрывают колпачком из парафинированной бумаги (для предотвращения испарения). Колбу помешают в термостат при температуре 45—47 "С на 10 сут. Затем ставят на водяную баню и кипятят в течение 20 мин, фильтруют и стерилизуют при давлении 5 • 10* Па в течение 15 мин.
Дрожжевой автолнзат хранят в холодильнике при температуре 4-6'С в течение двух недель.
3.12.3. В I дм ' водопроводной воды растворяют 10 г пептона. 5 г хлористого натрия и 5 г манннта, кипятят 15—20 мин, устанавливают рН 7.4—7.6. фильтруют через бумажный фильтр, вновь кипятят 10 мин и охлаждают до температуры 60 'С. Стерильно добавляют 30 см3 дрожжевого автолизата, 15 см' желчи крупного рогатого скота, 10 см' раствора хинозола (1:1000) и 10 см* 1.6 %-иого спиртового раствора бромкрезол-пурпурного. Среду разливают в стерильные пробирки по 7—8 см \
Цвет готовой среды — фиолетовый.
3.13. Приготовление среды X е й ф е и а
3.13.1. Для приготовления розоловой кислоты 0.5 г порошка заливают 10см' этилового ректификованного спирта: через 24 ч раствор готов к употреблению. Раствором можно пользоваться в течение месяца со дня приготовления.
Для приготовления метиленового голубого 0,1 г порошка заливают 100 см' дистиллированной волы. Через сутки раствор готов к употреблению. При хранении свойства его не изменяются, срок хранения не ограничен.
Краски хранить в темном месте при комнатной температуре.
3.13.2.13 I дм5 водопроводной волы растворяют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия и 5 г маннита, устанавливают pH 7.4 7.6. нагревают до кипения, фильтруют, добавляют I см' спиртового раствора 50 г/дм1 розоловой кислоты и 2.5 см* раствора I г/дм' метиленового голубого, стерилизуют однократно, нагревая 20 мин в аппарате Коха, или кипятят в колбе, закрытой ватной пробкой, в течение 5 мин.
Среду разливают по 7—9 см5 в стерильные пробирки размером 19x180 мм. Цвет среды в пробирках должен быть красно-фиолетовый.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.13.3. Среду Хейфеца двойной концентрации готовят аналогичным образом (п. 3.13.2). уменьшив количество водопроводной воды до объема 500 см'.
Среду разливают в пробирки по 10 см».
3.14. Приготовление среды К е с с л е р (модифицированной)
В I дм'дистиллированной воды помешают 10 г пептона. 50 см1 желчи, кипятят 30 мин. фильтруют через вату, добавляют 2.5 г лактозы и доводят объем дистиллированной водой до первоначального (1 дм5), добавляют 2 см' водного раствора 10 г/дм' иианвиолета. Среду рахтивают в пробирки с поплавками по 10 см1 и стерилизуют при давлении 5 • 10' Па в течение 15 мин. Среда имеет фиолетовый цвет.
Допускается замена поплавков клочками стерильной ваты.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.15. Приготовление среды Мюллер а
3.15.1. Ириготшиение раствора сериоватистокислога натрии
В мерный цилиндр с 50 г тиосульфата натрия добавляют дистиллированную воду до метки 100 см'. Полученный раствор стерилизуют однократно в аппарате Коха 20 мин.
3.15.2. Приготовление раствора Люголя
В 100 см' стерильной дистиллированной воды растворяют 25 г кристаллического йода и 20 г йодистого калия.
3.15.3. В стерильную колбу помещают 4,5 г х. ч. мела и стерилизуют сухим жаром при температуре 150 "С в течение 15 мин, наливают 90 см'мясо-пептонного бульона (по и. 3.8), стерилизуют в течение 30 мин при давлении 10* IIa. В колбу с мясо-пептонным бульоном и мелом стерильно добавляют 2 см4 раствора Люголя и 10 см' раствора серноватистокислого натрия, взбалтывают.
3.16. Приготовление среды Кауфмана
В 100 ем стерильной среды Мюллера, приготовленной по п. 3.15. стерильно добавляют 1 см* водного раствора 1 г/дм бриллиантовой зелени и 5 см1 стерильной желчи крупного рогатого скота. Смесь хорошо взбалтывают (не стерилизуют).
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.17. Приготовление среды Г и с с а
Для приготовления индикатора Лндреде в 100 ем' дистиллированной полы растворяют 18.4 см' I моль/дм1 раствора гидроокиси натрия и 0,3 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при давлении 5- 10' Па и хранят в темноте.
В 100 см' дистиллированной воды растворяют I г пептона и 0.5 г хлористого натрия при нагревании. Затем фильтруют до тех пор. пока раствор не станет совершенно прозрачным.
В фильтрате устанавливают pH 7.0. прибавляют 0,5 г углевода, а затем 1 см1 индикатора Лндреде. Полученную смесь разливают в пробирки с поплавками по 5 см'и стерилизуют 20 мин при давлении 5- 10* IIa.
Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка.
Допускается использовать готовые среды Гисса — сухой препарат с индикатором <-131*и манни-том. лактозой, сахарозой, глюкозой.
3.18. Среду Плоскирева приготавливают из сухой готовой среды.
3.19. Среду Левина приготавливают из сухой готовой среды.
3.20. Среду висмут-судьфит-агар приготавливают из сухой готовой среды.
3.21. Приготовление х л о р и с т о м а г н и е в о й среды «М» (м о д и ф и-и и р о в а н н о и)
Среда состоит из трех растворов А, В и С.
3.21.1. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2 дм1 дистиллированной поды растворяют I кг прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4-6 *С в течение 5 6 сут.
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2.5 см 0.01 %-ного раствора кристалл-виолета. рахчивают во флаконы иди пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 С в течение 30 мин.
Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4-6 'С в течение двух недель со дня приготовления.
3.21.2. Для приготовления раствора А в 90 см3 дистиллированной воды растворяют 0,42 г пептона, 0,7 г хлористого натрия, 0.15 г однозамешенного фосфорнокислого натрия. 2 см1 дрожжевого диализата. (При отсутствии дрожжевого диализата допускается заменять его дрожжевым экстрактом).
3.21.3. Дтя приготовления раствора В в 9 см дистиллированной воды растворяют 3.6 г кристаллического хлористого магния.
3.21.4. Раствор С состоит из 0.09 см1 водного раствора 50 г/дм1 бриллиантовой зелени.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.21.5. Дш приготовления хлористомагниевой среды «М» (модифицированной) растворы А. В и С смешивают и стерилизуют 30 мин при давлении 5-10' Па.
3.22. Приготовление среды К р у м в и д е-О лькен никого в модификации К о в а л ь ч у к а
В 1 дм' дистиллированной воды растворяют I г гипосульфита. 0.6 г соли Мора. 10 г мочевины. 15 г лактозы х. ч., 3,5 г сахарозы и 2 г глюкозы. Устанавливают рН среды до 7,4 7.6. Добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором BP. Все размешивают, кипятят в водяной бане в течение 40 мин. Разливают в пробирки по 5—6 см'. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 5• 10' lia. После стерилизации среду скашивают так, чтобы в пробирке остался столбик высотой не менее 3 см.
3.23. Приготовление агара с бриллиантовым, зеленым и феноловым красным ( БФА)
3.23.1. Для приготовления растворов красок:
0.5 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 см1 дистиллированной воды;
0,4 фенолового красного. 16 см3 0.1 моль/дм' гидроокиси натрия в IК4 см' дистиллированной
воды.
Оба приготовленных раствора в плотно закрытых флаконах выдерживают в термостате при температуре 37 "С в течение суток. Небольшим нерастворшшшмся осадком можно пренебречь.
3.23.2. Для приготовления смеси красок в 200 см' раствор фенолового красного добаатяют 5 см3 бриллиантового зеленого. Смесь хранят в холодильнике. Срок хранения смеси не ограничен.
3.23.3. В I дм3 дистиллированной воды вносят 50 г сухого питательного агара, 10 г лактозы, 40 см1 0.1 моль/дм3 соляной кислоты.
Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. затем в кипящей водяной бане не менее I ч. после чего на открытом огне (электроплитке) в течение 3 5 мин. фильтруют через lia ту (небольшой мутностью можно пренебречь).
Смесь разливают во флаконы, стерилизуют при давлении 5 • 10' Па в течение 30 мин и хранят в холодильнике до месяца со дня приготоачення.
3.23.4. В 100 см' среды с агаровой основой (п. 3.23.3), предварительно расплавленной и охлажденной до 45 'С, вносят 4,1 см3 смеси красок (п. 3.23.2). Среду разливают по чашкам Петри. Среда имеет цвет бутылочного стекла зеленовато-желтый.
3.24. Приготовление м о л о ч н о-с о л е в о г о агара
3.24.1. Дтя приготовления солевого мясо-пептонного агара 65 г/дм3 в 1 дм' расплавленного мясо-пептонного агара (пл. 3.4; 3.5) добавляют 65 г х. ч. хлористого натрия. Устанавливают рН -7.4. Стерилизуют ri автоклаве в течение 20 мин при давлении I0S Па.
3.24.2. В 100 см' расплавленного и охлажденного солевого агара ло 45 "С (п. 3.24.1) добавляют 10 см* стерильного обезжиренного молока, рахтивают по чашкам Петри. Среду хранят в холодильнике при температуре 4—9 "С в течение недели со дня приготовления.
3.25. Приготовление ж е л т о ч н о-с о л е в о г о агара (среды Чисто-в и ч)
3.25.1. Для приготовления желточного раствора в 200 см* стерильного физиологического раствора добавляют стерильно один яичный желток и раствор взбалтывают. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4—9 *С в течение одной недели со дня приготовления.
3.25.2. В 150 см' расплавленного и охлажденного до 45 *С солевого агара 65 г/дм' (п. 3.24.1) стерильно добавляют 50 см' желточного раствора, взбалтывают и рахтивают по чашкам Петри. Среду хранят в холодильнике при температуре 4—9 С в течение недели со дня приготовления.
3.26. Приготовление нитратной плазмы
К 8 см' свежей крови кролика добавляют стерильно 2 см' лимоннокислого натрия 50 г/дм и отстаивают в холодильнике при температуре 4 9 *С в течение суток.
Допускается использовать готовую сухую нитратную плазму.
3.25.2; 3.26. (Измененная редакция. Изм. № 2).
3.27. Приготовление бульона В а й н б е р г а
3.27.1. Приготовление мясной воды из сердца крупного рогатого скота
В I дм'водопроводной воды добавляют 1 кг сердца крупного рогатого скота, пропущенного через мясорубку. Медленно нагревают до кипения, кипятят 20 мин, охлаждают, снимают жир, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
3.27.2. Приготовление пенсин-пептониой воды
В 4 дм' водопроводной воды добавляют 400 г измельченной свежей печени крупного рогатого скота. 400 г измельченных свиных желудков. 40 г соляной кислоты (плотностью 1,19 г/см ), перемешивают, подогревают до 50 "С и оставляют при комнатной температуре на 18 24 ч. Затем кипятят в течение 10 мин, декантируют (осаждают), фильтруют, добавляют 8 г двузамещенного фосфорнокислого натрия, устанавливают pH 7.4.
3.27.3. Смешивают I дм' мясной воды из сердца крупного рогатого скота (п. 3.27.1) и 2 дм' пепсин-пептон ной воды (п. 3.27.2), устанавливают pH 7,8—8.2, разливают по колбам и стерилизуют 30 мин при давлении 10* Па.
3.28. Приготовление сухой среды КПД (кит о-п ептоин о-дрожжевой)
В 1 дм1 теплой дистиллированной воды добавляют 65 г сухого порошка КПД. Устанавливают pH 7.8—8,0 и разливают в стерильную посуду с ватой. Стерилизуют 30 мин при давлении 5 • 104 Па.
3.29. Приготовление ц и к л о с е р и н о в о Й среды (С Ц С)
В I дм1 питательной основы (бульон Хотппнера п. 3.7, бульон Вайнберга п. 3.27, сухая кито-пептонно-дрожжевая п. 3.28) добавляют последовательно 5 см1 раствора 100 г/дм'сернокислого железа, 10 см1 раствори 100 г/дм1 сульфита натрия (кристаллического) и 40 см раствора 10 г/дм1 Д-циклосернна. Все перечисленные компоненты готовят отдельно на стерильной дистиллированной воде. Не следует их смешивать вместе перед добавлением к основе, гак как может образоваться осадок.
Среду хранят в холодильнике при температуре 4—9 "С не более недели со дня приготовления.
3.30. Приготовление среды В и л ь с о н-Б л е р а
Раствор хлористого железа готовят на стерильной дистиллированной воде; раствор сернистокис-лого натрия стерилизуют в течение 1 ч текучим паром.
К 100 см' расплавленного и охлажденного до температуры 80 "С мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.4 или 3.5, добавляют I г глюкозы (pH не ниже 7,2), 10 см' раствора 200 г/дм* серннстокислого натрия и 1 см' раствора 80 г/дм' хлористого железа. Смесь рахшвают в стерильные пробирки столбиком высотой по 10 см3.
3.29; 3.30. (Измененная редакция, Изм. 2).
3.31. Приготовление мясной воды
1 кг мясного фарша, приготовленного из говядины высшего сорта, заливают 2 дм' водопроводной воды и настаивают в холодильнике 24 ч; затем кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К полученному фильтрату добавляют воду-до первоначального уровня.
Режим стерилизации 20 мин при давлении 10' Па.
3.32. Приготовление м я с о-п ептонного бульона (МПБ) и з мясной воды
В I дм' мясной воды добавляют 10 г пептона из 5 г хлористого натрия. Затем устанавливают рН 7.3—7.4. кипятят в течение 20 мин и фильтруют. Раствор стерилизуют 20 мин при давлении 10' 11а.
3.33. Подготовка проб
В зависимости от вида продукта объединенную пробу массой 50 г составляют из точечных проб следующим образом:
колбасные изделия в оболочке и продукты из свинины, баранины и говядины помешают в металлический или эмалированный тазик (тарелку ), тщательно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и дважды обжигают над пламенем (спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962).
Затем батоны разрезают продольно стерильным (фламбированиым) ножом или скальпелем на две половинки, не рассекая оболочку противоположной стороны батона. Пробу отбирают из нескольких участков центральной части и из-под оболочки обеих половинок батона;
из свиных, бараньих, говяжьих продуктов на костях и из бекона пробы вырезают стерильным инструментом из различных участков обожженного образца на глубине 2—3 см от поверхности, предпочтительно ближе к кости;
изделия без оболочки (мясные хлебы, паштеты, студни и другие изделия) исследуют с поверхности и в глубине продукта.
Для анализа поверхности изделий без оболочки, после развертывания упаковки, с поверхности исследуемых образцов делают смыв (с каждого образца новым стерильным увлажненным ватным тампоном) с тех участков, с которыми могли соприкасаться руки упаковщика.
Тампоны помешают в пробирки, заполненные на*/, их высоты средой «ХБ». Хейфена или 5 см1 среды Кесслер.
Дтя анализа глубинных участков проду кта образцы помешают в металлический или эмалированный тазик (тарелку), смачивают спиртом и обжигают. Затем делают продольный разрез и отбирают навеску методом, указанным для колбасных изделий и продуктов в оболочке, составляя из них одну объединенную пробу для каждого образца в отдельности, которую помешают в предварительно взвешенную стерильную бюксу или чашку 11етри.
3.34. Из объединенной пробы каждого образца берут в стерильную посуду (пергамент) навеску массой 20 г с погрешностью, не превышающей 0,1 г.
Навеску помешают в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора для приготовления испытуемой взвеси. Для этого в колбу добавляют раствор 1 г/дм1 пептонной волы или стерильного физиологического раствора в четырехкратном количестве и гомогенизируют в электрическом смесителе; вначале измельчают материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000— 20000 об/мин в течение 2,5 мин.
Допускается при отсутствии гомогенизатора приготовление испытуемой взвеси в ступке путем растирания 20 г продукта в стерильной фарфоровой ступке с 2—3 г стерильного песка, постепенно приливая 80 см' раствора I г/дм3 пептонной волы или стерильного физиологического раствора. При растирании проб вареных изделий мажущейся консистенции (ливерные, кровяные колбасы) стерильный песок можно не добавлять.
Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирают взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре.
1 см' приготовленной испытуемой взвеси содержит 0,2 г продукта.
(Измененная редакция, Изм. № I. 2).
4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
4.1. Определение общего количества микробов в I г продукта
Метод не распрос траняется на сырокопченые колбасы.
4.1.1. Сущность метода заключается в способности мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на питательном агаре при температуре (30 ± 0.5) *С с образованием колоний, видимых при увеличении 5х.
4.1.2. Проведение анализа
Питательный агар, приготовленный по пп. 3.4: 3.5, расплавляют на водяной бане и охлаждают до температуры 45 "С.
Стерильные чашки Петри раскладывают на столе, подписывают наименование анализируемого продукта, дату посева и количество посеянного продукта.
Из каждой пробы должно быть сделано не менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При этом на одну чашку Петри проводят посев 0.1 г, а на другую 0.01 г продукта.
Ятя посева 0.1 г продукта готовят первое десятикратное разведение испытуемой взвеси: стерильной пипеткой с широким конном отбирают 5 см1 испытуемой взвеси (приготовленной по п. 3.33), переносят ее в пробирку с 5 см' стерильного физиологического раствора или пептонной воды. Коней пипетки должен быть опушен ниже поверхности раствора, не прикасаясь к стенкам пробирки, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. 1 см' полученного раствора содержит 0.1 г испытуемого продукта.
Другой стерильной инпегкой тщательно перемешивают содержимое пробирки продуванием, отбирают 1 см( и переносят в стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.
Ятя посева 0.01 г продукта готовят следующее разведение: другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают 1 см' и переносят в пробирку с 9 см* стерильного физиологического раствора. 1 см' испытуемого раствора вторичного разведения содержит 0,01 г испытуемого продукта. 1 см' этого раствора переносят в стерильную чашку Петри, как описано выше. При необходимости таким же образом готовят последующие разведения.
После внесения разведения анализируемой взвеси в чашки Пегри чашку заливают 12 15 см* расплавленного и охлажденного питательного агара при фламбнровании краев пробирки или бутылки, где он содержится. Быстро смешивают с мясо-пептоиным питательным агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, неза-литых участков дна чашки Петри, попадания среды на края и крышку чашки.
Я™ того, чтобы помешать развитию на поверхности агара спорообразуюших микробов и бактерий 1руппы протея в Н-форме, допускается наслоение расплавленного и охлажденного до температуры 45—50 *С голодного агара толщиной 3 -4 мм.
Посте застывания агара чашки Петри перевертывают и помешают в термостат с температурой 30 'С на 72 ч. Через 72 ч подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на чашках.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Ятя этого чашку кладут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.
4.1.1. 4.2.1. (Измененная редакция. Изм. № 2).
4.1.3. Обработка результатов
Ячя определения общего количества микробов в I г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень разведения анализируемого продукта.
За окончательный результат определения количества бактерий в I г анализируемого продукта принимают среднеарифметическое значений результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.
4.2. Определение бактерий группы кишечной палочки в I г продукта
4.2.1. Сущность метода заключается на способности бактерий фуппы кишечной папочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в средах «ХБ», Хейфена и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а вереде Кесслер в поплавке образуется газ вследствие расщепления лактозы.
Цель определения этой группы бактерий проверка соблюдения режима варки колбас или санитарно-гигиенических условий в процессе производства сырокопченых колбасных изделий.
При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической дифференциации.
4.2.2. Проведение анализа
И пробирки, содержащие по 5 см1 среды «ХБ». среды Хейфеиа двойной концентрации или среды КОЯ\. вносят по 5 см1 испытуемой взвеси (пп. 3.33; 3.34) стерильной пипеткой вместимостью 5—10 см5 с широким концом.
Допускается применение среды Кесслер по 10 см3.
Пробирки со средой «ХБ» или Кесслер. или Хейфеца, или КОДА помешают и термостат с температурой (37 ± 0.5) "С на 18—20 ч.
Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 43 "С (для обнаружения повторного бактериального загрязнения).
При росте бактерий группы кишечной палочки среды «ХБ» и КОДА окрашиваются в желтый цвет, среда Хейфеца приобретает также желтый цвет, который может меняться до салатно-зеленого, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.
Дчя окончательного заключения о присутствии в продукте бактерий группы кишечной палочки проводят высев со среды Кесслер (забродившие пробирки) или Хейфеца ( изменение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо или Плоскирева. или Левина. Чашки Петри помешают в термостат с температурой 37 'С. Через 18 20 ч посевы просматривают. На среде Эндо бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или ро-зово-красные без блеска, на среде Плоскирева кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина темно-фиолетовые колонии или фиолетово-черные блестящие. Из подозреваемых колоний готовят мазки, которые окрашивают по Граму.
Специфическое изменение среды «ХБ» и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.
При заведомо высокой обсеменности анализируемый продукт массой не более 0,25 г помешают в пустую пробирку, в которую закладывают комочек стерильной фильтровальной бумаги размером 5x5 см. и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой проталкивают материал до дна (не уплотняя), в пробирку наливают среду «ХБ», КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации), заполняя ее на 3Д высоты пробирки. Пробирки помешают в термостат с температурой 37 "С на 8—10 ч. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде «ХБ-> и КОДА среда изменяет свой цвет из фиолетово-пурпурного в желтый. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде Хейфеца среда изменяет свой цвет из красно-фиолетового в желтый, который затем может меняться до салатно-зеленого.
Пробы, отобранные с поверхности изделий без оболочки тампонами, анализируют аналогично.
4.2.3. Обработка результатов
Обнаружение грамотрицательных не образующих спор палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.
4.2.1 4.2.3. (Измененная редакция. Изм. № 2).
4.3. Определение бактерий из рода сальмонелл в 25 г продукта
4.3.1. Сущность метода заключается в определении характерного роста сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств.
4.3.2. Проведение анализа
Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы вносят во флакон Сокслета, содержащий 100 см1 среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористомагниевой среды М). Жидкость во флаконе должна подняться до метки 125 см3. Флаконы тщательно встряхивают и помешают в термостат с температурой 37 'С. Через 16 24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли (диаметр 0.4 0,5 мм) или пастеровской пипетки проводят посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева. Левина или висмут-сульфит-агар (110 выбору).
Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 37 "С; посевы просматривают через 16—48 ч. на висмут-сульфит-агаре — через 24 48 ч.
На среде Эндо бактерии из рода сельмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии.
На среде БФА сальмонеллы образуют крупные, гладкие, красноватого оттенка прозрачные колонии (колонии сальмонеллы тнфи сунс, как и на среде Эндо мелкие). Бактерии группы кишечной палочки образуют колонии желто-зеленоватого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 ч.
На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но колонии более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо.
На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют некоторые серологические типы из группы С, которые на этой среде растут в виде нежных светло-зеленых или крупных серовато-зеленых колоний.
Изолированные колонии, характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевают на грехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Посевы помешают на 12 16 ч в термостат с температурой 37 С.
При росте бактерий из рода сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука розовый, столбик желто-бурый; газообразование устанавливают по наличию трешин и разрыву столбика агара, сероводоролообразуюшие вызывают потемнение столбика.
Другие грамнегативные бактерии дают следующие изменения цвета среды:
бактерии группы кишечной палочки вся среда окрашивается в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;
бактерии из группы протея — среда окрашивается в ярко-красный цвет, может образоваться черный осадок:
шигеллы и возбудители брюшного тифа — косяк окрашивается в розовый цвет, столбик и синий или сине-зеленый.
Допускается вместо среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука посев на углеводные среды в короткий пестрый ряд. включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой, полужидкий агар уколом (для определения подвижности) и бульон Хот-тннгера для определения образования индола и сероводорода.
Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, которые окрашивают но Граму, микро-скопируют и изучают серологические свойства микроорганизмов путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной саль-монеллезной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с поливалентной сывороткой проводят идентификацию с помошыо монорецепторных агглютинирующих О-сыгюроток.
Установив серологическую группу, к которой относятся исследуемые бактерии, с помощью Н-сывороток определяют тип бактерий.
(Измененная релакиия. Изм. № 1. 2).
4.3.3. Обработка резулынапш
Обнаружение подвижных (кроме S.pullorum и S.gallinarum) грамотрицательных палочек, даюшнх характерный рост на элективных средах, неферментируюших лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S.typhi suis, не ферментирует маннит). даюшнх положительную реакцию агглютинации с моиорецепторными О- и Н-сальмо-неллезными сыворотками, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.
4.4. Определение протея
4.4.1. Сущность метода заключается в определении морфологии и роста на питательных средах, способности гидролнзовагь мочевину и образовывать сероводород.
4.4.2. Проведение анализа
Ятя подтверждения наличия протея в Н-форме 0.5 см' анализируемой взвеси (прнготоатенной по п. 3.34) вносят в конденсационную воду свсжескошенного мясо-пептонного агара, рахчитого в широкие пробирки, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича). Вертикально поставленные пробирки помешают в термостат с температурой 37 "С. Через 18—24 ч посевы просматривают. Обращают внимание на образование ползучего вуалеобразиого налета с голубым оттенком; на скошенном мясо-пептониом агаре культура поднимается из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды. При появлении характерного роста микробов рода протея, микроскопируют окрашенные по Граму мазки и изучают подвижность микробов в раздавленной или висячей капле.
Ятя обнаружения нерояшнхся «О-форм» можно проводить посев на поверхность агара Плос-кирева. -О-форма» протея растет на этой среде в виде прозрачных колоний, слегка подщелачивающих среду, окрашивая ее в желтый цвет. Делают пересев материала из подозрительных колоний в среду Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука, где при наличиии бактерий из группы протея среда окрашивается в ярко-красный цвег (вследствие расщепления мочевины) и может образовываться черный осадок с возможным разрывом агарового столбика (вследствие образования сероводорода). 4.4.3. Обработка результатов
Обнаружение полиморфных грамотринательных палочек, образующих характерный рост на средах и Н-форме (подвижные) и О-форме (неподвижные), ферментирующих глюкозу и мочевину, неферментируюшнх лактозу и маннит, указывает на наличие бактерий из рода протея.
4.5. Определение коагулазополож и тельных стафилококков
4.5.1. Сущность метода заключается в определении морфологии, характера роста на питательных средах и в способности отдельных стафилококков продуцировать лецитиназу и коагулировать нитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
4.5.2. Проведение анатза
Из разведения анализируемой взвеси продукта (1:10) проводят посевы на молочно-солевой агар, содержащий 65 г/дм3 хлористого натрия, для выявления пигмента или ж ел точно-солевой агар, содержащий 65 г/дм3 хлористого натрия, для выявления лецитиназной активности.
В »весь наносят на поверхность агара в количестве 0,2 см ' и равномерно растирают по всей поверхности агаровой среды.
Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 "С и 24 ч выдерживают при комнатной температуре.
На поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид плоских или слегка выпуклых блестящих колоний с ровным краем. При этом на молочно-солевом агаре лучше выявляется пигмент (эмалево-белый или золотистый), а на желточно-солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенностн.
Из подозрительных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму. При наличии стафилококков в препарате обнаруживаются грамположительные мелкие кокки, располагающиеся неправильными гроздьями.
Для подтверждения признаков патогенности стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляиии. В приборе 0,5 см' нитратной плазмы крови кролика, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:4. вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при темперазу-ре 37 "С. Реакцию плазмокоагуляиии учитывают через 3—4 ч (не встряхивая пробирку ) и оставляют в термостате на сутки для окончательного учета через 24 ч.
Дзя постановки реакции плазмокоагуляиии можно использовать также сухую нитратную плазму крови кролика.
Реакцию считают положительной, если плазма коагулируется в сгусток.
(Измененная редакция. Изм. № 1, 2).
4.5.3. Обработка результатов
Дчя определения количества стафилококков учитывают колонии стафилококков, давшие положительную реакцию плазмокоагуляиии.
При расчете на 1 г продукта количество подсчитанных колоний умножают на степень разведения и делят на количество посевного материала.
(Измененная редакция. Изм. № 1).
4.6. Определение с у л ь ф и т в о с с т а н а в л и в а ю ш и х к л о с т р и д и й
4.6.1. Сущность метода заключается в специфическом росте сульфитвосстанавливаюших клострн-дий вередах СЦС или Вильсон-Блера, на которых в результате восстановления сернистокислого натрия в сернокислый натрий происходит взаимодействие с хлористым железом и образуется почернение среды за счет сернистого железа.
4.6.2. Проведение инаипа ни сулъфипщиклосериновой среде (СЦС)
1 см' анализируемой взвеси (1:10 по п. 4.1.2) стерильной пипеткой вносят в пробирку с 9 см-жидкий сульфит-циклосериновой среды, затем проводят последовательные пересевы на аналогичные объемы среды, в результате чего получают возрастающие десятикратные разведения суспензии. Инкубацию проводят при 46 "С в течение N 12 ч. При наличии роста сульфитвосстанавливаюших клостридий образуется почернение среды.
4.6.1, 4.6.2. (Измененная редакция. Изм. № 1. 2).
4.6.2а. Проведение анализа на среде Вильсон-Блера
В пробирки, содержащие по 9 см' расплавленной и охлажденной до температуры 45 С среды Вильсон-Блера. вносят стерильной пипеткой по I см' десятикратных разведений (от 10 ' до 10 ') взвеси испытуемого продукта. Посевной материал и среду тщательно перемешивают. Посевы поме- тают в термостат с температу рой 46 'С на 8 12 ч или 37 'С на 20 ч. Появление в среде черных колоний или почернение всей среды указывает на присутствие сульфит-восстанавливаюших кло-стрндий.
Почернение среды Вильсон-Блера могут вызвать многие энтеробактерни. Для подтверждения роста сульфитвосстанавливаюших клосгрндий используют пересев в пробирки со средой Китта-Тароцци, предварительно прогретой в течение 25 мин в кипящей водяной бане и быстро охлажденной до 45 "С. Термостатирование посевов проводят при (37 ± 0,5) 'С. ежедневно в течение 5 сут проверяя н них помутнение среды, выделение газа, появление постороннего запаха, иногда разложение кусочков печени. Сразу после появлении признаков роста готовят микроскопический препарат. Материал для этого берут пастеровской пипеткой со дна пробирки. При микроскопнровании отмечают грамгю-ложительные палочки, образующие овальные споры.
У спорообразуюших I рам положи тельных микроорганизмов выявляют каталазную активность с помощью раствора перекиси водорода 30 г/дм1. Отсутствие пузырьков газа при добавлении к капле культуральной жидкости такого же количества перекиси водорода позволяет считать, что в посевах присутствуют микроорганизмы из рода клострндий.
В случае отсутствия спор в микроскопическом препарате положительной пробы на каталазу. присутствия в посевах смешанной микрофлоры, 1 —2 капли накопительной среды переносят в стерильную чашку Петри, заливают расплавленной и охлажденной до 45 'С средой Вильсон-Блера. Застывшую поверхность плотной среды заливают холодным агаром. Посевы термостатируют 24—48 ч при (37 ± 0.5) *С. Появление в нижнем слое агара черных или коричневых колоний свидетельствует о присутствии в посевах сульфитвосстанавливаюших клострндий.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
4.6.3. Об/мботка [>езулшатов
За положительный титр клострндий (сульфит-восстановителей) принимают то максимальное разведение суспензий, в посеве которого произошло почернение среды. Например, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10 ', то считают, что в исследуемом продукте будет 10 (или I • 10') клеток в I г, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10 -. то считают, что в исследуемом продукте 100 (или I * 10-') микробных клеток в I г.
Настояший стандарт распространяется на колбасные изделия (фаршированные, пареные, полукопченые. парено-копченые, сырокопченые, ливерные и кровяные колбасы, мясные хлебы, сосиски, сардельки, паштеты, зельцы, студни), продукты из мяса (из свинины, говядины, баранины, из мяса других видов убойного скота и птицы) и устанавливает методы бактериологического анализа: определения общего количества микробов; определения бактерий группы кишечной палочки; определения бактерий из рода сальмонелл; определения бактерий группы протея; определения коагулазоположительиых стафилококков: определения сульфитвосстанашшвающих клострилий.
I. ОТБОР ПРОБ
1.1. Огбор точечных проб для бактериологического анализа проводят по ГОСТ 9792.
1.2. Пробы хранят при температуре 6—8 'С. Анализ проводят не позднее, чем через 4 ч с момента отбора проб.
2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ, РЕАКТИВЫ
2.1. Для проведения бактериологического анализа применяют следующие аппаратуру, материалы и реактивы:
автоклав вертикальный по ТУ 27-31—2939; аппарат Коха;
весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104*:
гомогенизатор бактериологический, смеситель или аппарат для измельчения тканей: микроскоп марок МБИ и МБР или других аналогичных марок; мясорубку бытовую по ГОСТ 4025; потенциометр;
термостат электрический с автоматическим терморегулятором;
термостат или водяную баню с терморегулятором;
холодильник электрический бытовой по ГОСТ 16317;
шкаф сушильный лабораторный:
бумагу парафинированную по ГОСТ 9569;
бумагу фильтровальную лабораторную по ГОС Т 12026;
пату медицинскую гигроскопическую по ГОСТ 5556;
воронки В-36 80 ХС. ВФ-1—75 ХС по ГОСТ 25336,
лупы с увеличением 3' и 5' ;
марлю медицинскую по ГОСТ 9412;
марлю бытовую по ГОСТ II109;
ножницы медицинские по ГОСТ 21239;
петлю бактериологическую;
палочки стеклянные;
пинцеты медицинские по ГОСТ 21241;
пипетки Мора вместимостью 25 и 50 см5;
термометры стеклянные технические по ГОСТ 28498;
пипетки пастеровские;
пипетки 7-1-1; 7-1-2; 7-1-5; 7-1-10; 8-2-0,1 по ГОСТ 29169;
пробирки 112 10-90 ХС; 113-5 ХС по ГОСТ 25336;
скальпель медицинский по ГОСТ 21240;
стаканы В-1-250 ТС; Н-2-100 ТХС по ГОСТ 25336;
колбы К-2—250—34 ТХС; 11-2-250-34 ТХС по ГОСТ 25336;
спиртовка СЛ-1 по ГОСТ 25336;
стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284; стекла покровные для микропрепаратов по ГОСТ 6672; ступки фарфоровые с пестиком по ГОСТ 9147; флаконы Сокслета;
цилиндры 2- 100; 4-100; 4-25 по ГОСТ 1770;
колбы мерные 2-100-2; 2-250-2; 2-1000 2 по ГОСТ 1770;
часы песочные на 1, 2. 5 мин;
чашка ЧЬН-1—40 по ГОСТ 25336;
штативы для пробирок;
агар микробиологический по ГОСТ 17206;
агар Эндо. сухой;
белок яичный;
бриллиантовый зеленый;
воду бромную;
бромкрезолпурпур;
бульон мясо-пептонный по ГОСТ 20730;
поду дистиллированную по ГОСТ 6709;
воду мясную по ГОСТ 20729;
ген циан-виолет;
гилролизат рыбный сухой;
глюкозу кристаллическую по ГОСТ 975. х. ч.;
глицерин по ГОСТ 6259. х. ч.;
дрожжи хлебопекарные прессованные по ГОСТ 171;
диализат лрожжспой;
железо сернокислое по ГОСТ 4148;
железо хлористое:
желчь крупного рогатого скота;
йод по ГОСТ 4159;
калий йодистый по ГОСТ 4232;
калии фосфорнокислый однозамешенный по ГОСТ 4198. ч. д. а.; калий фосфорнокислый двузамешенный по ГОСТ 2493. ч. д. а. кальций углекислый по ГОСТ 4530; кислоту розоловую;
кислоту соляную по ГОСТ 14261. ос. ч., плотносгью 1.19 г/см'; кристалл-виолет; лактозу, х. ч.; манннт, х. ч.;
магний сернокислый по ГОСТ 4523; магний хлористый по ГОСТ 4209. х. ч.;
масло вазелиновое медицинское по ГОСТ 3164;
масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;
метиленовый голубой;
мел химический осажденный по ГОСТ 8253;
мочевину по ГОСТ 6691, х. ч.;
набор адсорбированных поливалентных сывороток и монорецепторных агглютинирующих О и Н сальмонелле зных сывороток;
натрий двууглекислый по ГОСТ 4201;
натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
натрий кислый селенистокислый (без теллура);
натрий сернистокислый безводный по ГОСТ 195;
натрий фосфорнокислый однозамещенный по ГОСТ 245. ч. д. а.;
натрий фосфорн о кислый двузамешенный безводный по ГОСТ 11773, ч. д. а.;
натрий хлористый по ГОСТ 4233, х. ч.;
панкреатин;
парад и метил амидобен зал ьдегид;
пептон сухой ферментативный для бактериологических целей по ГОСТ 13805; песок кварцевый для тонкой керамики по ГОСТ 7031; плазму нитратную сухую (кроличью); сахарозу по ГОСТ 5833. х. ч.;
соль закиси железа и аммония двойную сернокислую (соль Мора) по ГОСТ 4208;
спирт этиловый ректификованный технический по ГОСТ 18300;
спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962*;
среду Вильсон-Блера (сухую);
среду КОДА, сухую питательную;
среду Левина сухую;
среду Плоскнрева сухую;
среду кито-пентоно-дрожжевую. сухую (среду КПД);
среды сухие с углеводами и индикатором *ВР» (среды Гисса);
натрий серноватистокислый по ГОСТ 27068. х. ч.;
фуксин (основной и кислый) для микробиологических целей;
хинозол;
хлороформ по ГОСТ 20015; Д-инклосерин.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3. ПОДГОТОВКА К АНАЛИЗУ
3.1. Окраску препаратов по [ раму проводят по ГОСТ 21237.
3.2. Приготовление физиологического раствора
8.5 г хлористого натрия растворяют в I дм' водопроводной воды. Раствор стерилизуют при давлении 10* Па в течение 20 мин.
3.3. Приготовление пептон пой воды
В 1 дм' дистиллированной воды добавляют 10 г пептона и 5 г хлористого натрия. Жидкость подогревают до растворения пепгона, фильтруют, устанавливают рН 7.2—7.4 и стерилизуют при давлении 10* Па в течение 20 мин.
3.4. Приготовление мясо-пептон ного агара (МПА)
В 1 дм5 мясо-пептонного бульона добавляют 20 г агара-агара и кипятят при слабом нагревании, постоянно помешивая до полною растворения агара. Устанавливают рН среды 7,0—7.2.
Охлаждают до температуры 50 - 55 "С и осветляют яичным белком (из расчета белок одного яйца на 1 дм1 мясо-пептонного агара). Помещают агар в автоклав (не завинчивая крышку) или в аппарат Коха на 1 ч. чтобы белок свернулся и. оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий раствор фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Рахчивают во флаконы и пробирки и стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при давлении 10' Па.
3.5. Питательная среда может быть приготовлена из сухого питательного агара.
3.6. Приготовление голодного агара
2 г агара-агара растворяют в 100 см1 водопроводной воды. Раствор стерилизуют при давлении 10' Па в течение 20 мин.
3.7. Приготовление бульона Хоттиигера
В 1 дм' кипящей водопроводной воды опускают на 20 мин 1 кг мяса, освобождеиного от костей, жира и сухожилий, нарезанного мелкими кусочками. Затем мясо вынимают, измельчают на мясорубке. снова кладут в тот же отвар. Добавляют 40 г измельченной поджелудочной железы, очищенной от жира и дважды пропущенной через мясорубку (вместо поджелудочной железы можно брать 5 г панкреатина), доливают 20 см1 хлороформа. Бутыль плотно закрывают пробкой и энергично встряхивают (пробку надо придерживать). Смесь оставляют для переваривания в термостате при 45 "С до 20 сут. Мясо в виде мелкозернистой массы оседает на дно бутыли. Жидкость над мясом должна быть прозрачной. Эту жидкость сливают и стерилизуют при 10' Па в течение 20 мин. Готовый раствор дает положительную реакцию на триптофан с бромной водой.
3.7.1. Приготовление бромной воды
3—3.5 см5 чистого брома растворяют в 100 см' дистиллированной (стерильной) воды.
3.8. Приготовление м я с о-п е п т о и и о г о бульона (МПБ) на основе бульона Хоттингера
Основной раствор Хоттиигера разводят в 5- 10 раз (до соломенного цвета). На I дм1 разведенного бульона берут 10 г пептона и 5 г хлористого натрия. Затем устанавливают рН 7,3—7.4. кипятят 20 мин и фильтруют.
Режим стерилизации 20 мин при давлении 10' Па.
3.9. Приготовление среды Эндо
В 100 см4 расплавленного мясо-пептонного агара добавляют I г лактозы, растворенной в 5 см водопроводной воды, прокипяченной в течение 5 мин. МИЛ охлаждают до температуры 60—70"С и к нему добавляют смесь расгворов основного фуксина и серн истокисл ого натрия. Для приготовления смеси 0,5 г сернистокислого натрия растворяют в 5 см' стерильной воды, кипятят в течение 5 мин добавляют 1 см спиртового раствора 100 г/дм' основного фуксина. После перемешивания среду разливают в чашки Петри. Среда Эндо в чашках должна иметь бледно-розовый цвет.
Среду Эндо готовят в день ее использования.
(Измененная редакция. Нзм. № 2).
3.10. Среда Эндо может быть приготовлена из сухой готовой среды.
3.11. Приготовление среды КОДА (сухая готовая) проводят согласно инструкции, утвержденной в установленном порядке.
3.12. Приготовление среды «ХБ (х и и о зо л- б ро м кре зол-п у р п у р но й)
3.12.1. Для приготовления бром крезол-пурпура 0,8 г порошка заливают 50 см* этилового ректификованного спирта. Через день раствор готов к употреблению.
Раствором можно пользоваться в течение месяца со дня приготовления.
Для приготовления хинозола 0,1 г порошка растворяют в 100 см1 стерильной дистиллированной воды. При хранении свойства его не изменяются. Срок хранения не ограничен.
Краски хранить в темном месте при комнатной температуре.
3.12.2. Приготовление дрожжевого автализата
В 600 см1 стерильной воды растворяют 1 г однозамещеиного фосфорнокислого калия и 0.1 г сернокислого магния, затем добавляют 100 г прессованных хлебных дрожжей и взбалтывают до получения суспензии. В колбу с суспензией наливают N 10 см хлороформа, закрывают ватной пробкой и накрывают колпачком из парафинированной бумаги (для предотвращения испарения). Колбу помешают в термостат при температуре 45—47 "С на 10 сут. Затем ставят на водяную баню и кипятят в течение 20 мин, фильтруют и стерилизуют при давлении 5 • 10* Па в течение 15 мин.
Дрожжевой автолнзат хранят в холодильнике при температуре 4-6'С в течение двух недель.
3.12.3. В I дм ' водопроводной воды растворяют 10 г пептона. 5 г хлористого натрия и 5 г манннта, кипятят 15—20 мин, устанавливают рН 7.4—7.6. фильтруют через бумажный фильтр, вновь кипятят 10 мин и охлаждают до температуры 60 'С. Стерильно добавляют 30 см3 дрожжевого автолизата, 15 см' желчи крупного рогатого скота, 10 см' раствора хинозола (1:1000) и 10 см* 1.6 %-иого спиртового раствора бромкрезол-пурпурного. Среду разливают в стерильные пробирки по 7—8 см \
Цвет готовой среды — фиолетовый.
3.13. Приготовление среды X е й ф е и а
3.13.1. Для приготовления розоловой кислоты 0.5 г порошка заливают 10см' этилового ректификованного спирта: через 24 ч раствор готов к употреблению. Раствором можно пользоваться в течение месяца со дня приготовления.
Для приготовления метиленового голубого 0,1 г порошка заливают 100 см' дистиллированной волы. Через сутки раствор готов к употреблению. При хранении свойства его не изменяются, срок хранения не ограничен.
Краски хранить в темном месте при комнатной температуре.
3.13.2.13 I дм5 водопроводной волы растворяют 10 г пептона, 5 г хлористого натрия и 5 г маннита, устанавливают pH 7.4 7.6. нагревают до кипения, фильтруют, добавляют I см' спиртового раствора 50 г/дм1 розоловой кислоты и 2.5 см* раствора I г/дм' метиленового голубого, стерилизуют однократно, нагревая 20 мин в аппарате Коха, или кипятят в колбе, закрытой ватной пробкой, в течение 5 мин.
Среду разливают по 7—9 см5 в стерильные пробирки размером 19x180 мм. Цвет среды в пробирках должен быть красно-фиолетовый.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.13.3. Среду Хейфеца двойной концентрации готовят аналогичным образом (п. 3.13.2). уменьшив количество водопроводной воды до объема 500 см'.
Среду разливают в пробирки по 10 см».
3.14. Приготовление среды К е с с л е р (модифицированной)
В I дм'дистиллированной воды помешают 10 г пептона. 50 см1 желчи, кипятят 30 мин. фильтруют через вату, добавляют 2.5 г лактозы и доводят объем дистиллированной водой до первоначального (1 дм5), добавляют 2 см' водного раствора 10 г/дм' иианвиолета. Среду рахтивают в пробирки с поплавками по 10 см1 и стерилизуют при давлении 5 • 10' Па в течение 15 мин. Среда имеет фиолетовый цвет.
Допускается замена поплавков клочками стерильной ваты.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.15. Приготовление среды Мюллер а
3.15.1. Ириготшиение раствора сериоватистокислога натрии
В мерный цилиндр с 50 г тиосульфата натрия добавляют дистиллированную воду до метки 100 см'. Полученный раствор стерилизуют однократно в аппарате Коха 20 мин.
3.15.2. Приготовление раствора Люголя
В 100 см' стерильной дистиллированной воды растворяют 25 г кристаллического йода и 20 г йодистого калия.
3.15.3. В стерильную колбу помещают 4,5 г х. ч. мела и стерилизуют сухим жаром при температуре 150 "С в течение 15 мин, наливают 90 см'мясо-пептонного бульона (по и. 3.8), стерилизуют в течение 30 мин при давлении 10* IIa. В колбу с мясо-пептонным бульоном и мелом стерильно добавляют 2 см4 раствора Люголя и 10 см' раствора серноватистокислого натрия, взбалтывают.
3.16. Приготовление среды Кауфмана
В 100 ем стерильной среды Мюллера, приготовленной по п. 3.15. стерильно добавляют 1 см* водного раствора 1 г/дм бриллиантовой зелени и 5 см1 стерильной желчи крупного рогатого скота. Смесь хорошо взбалтывают (не стерилизуют).
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.17. Приготовление среды Г и с с а
Для приготовления индикатора Лндреде в 100 ем' дистиллированной полы растворяют 18.4 см' I моль/дм1 раствора гидроокиси натрия и 0,3 г кислого фуксина. Раствор стерилизуют 5 мин при давлении 5- 10' Па и хранят в темноте.
В 100 см' дистиллированной воды растворяют I г пептона и 0.5 г хлористого натрия при нагревании. Затем фильтруют до тех пор. пока раствор не станет совершенно прозрачным.
В фильтрате устанавливают pH 7.0. прибавляют 0,5 г углевода, а затем 1 см1 индикатора Лндреде. Полученную смесь разливают в пробирки с поплавками по 5 см'и стерилизуют 20 мин при давлении 5- 10* IIa.
Среда должна быть бесцветной или соломенно-желтого цвета, без розового оттенка.
Допускается использовать готовые среды Гисса — сухой препарат с индикатором <-131*и манни-том. лактозой, сахарозой, глюкозой.
3.18. Среду Плоскирева приготавливают из сухой готовой среды.
3.19. Среду Левина приготавливают из сухой готовой среды.
3.20. Среду висмут-судьфит-агар приготавливают из сухой готовой среды.
3.21. Приготовление х л о р и с т о м а г н и е в о й среды «М» (м о д и ф и-и и р о в а н н о и)
Среда состоит из трех растворов А, В и С.
3.21.1. Приготовление дрожжевого экстракта
В 2 дм1 дистиллированной поды растворяют I кг прессованных хлебопекарных дрожжей. Полученную суспензию стерилизуют 30 мин текучим паром, затем отстаивают в холодильнике при температуре 4-6 *С в течение 5 6 сут.
Жидкость над осадком декантируют, приливают 2.5 см 0.01 %-ного раствора кристалл-виолета. рахчивают во флаконы иди пробирки и вновь стерилизуют при температуре 100 С в течение 30 мин.
Экстракт хранят в холодильнике при температуре 4-6 'С в течение двух недель со дня приготовления.
3.21.2. Для приготовления раствора А в 90 см3 дистиллированной воды растворяют 0,42 г пептона, 0,7 г хлористого натрия, 0.15 г однозамешенного фосфорнокислого натрия. 2 см1 дрожжевого диализата. (При отсутствии дрожжевого диализата допускается заменять его дрожжевым экстрактом).
3.21.3. Дтя приготовления раствора В в 9 см дистиллированной воды растворяют 3.6 г кристаллического хлористого магния.
3.21.4. Раствор С состоит из 0.09 см1 водного раствора 50 г/дм1 бриллиантовой зелени.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
3.21.5. Дш приготовления хлористомагниевой среды «М» (модифицированной) растворы А. В и С смешивают и стерилизуют 30 мин при давлении 5-10' Па.
3.22. Приготовление среды К р у м в и д е-О лькен никого в модификации К о в а л ь ч у к а
В 1 дм' дистиллированной воды растворяют I г гипосульфита. 0.6 г соли Мора. 10 г мочевины. 15 г лактозы х. ч., 3,5 г сахарозы и 2 г глюкозы. Устанавливают рН среды до 7,4 7.6. Добавляют 46 г сухой среды с сахарозой и индикатором BP. Все размешивают, кипятят в водяной бане в течение 40 мин. Разливают в пробирки по 5—6 см'. Среду, разлитую в пробирки, стерилизуют 20 мин при давлении 5• 10' lia. После стерилизации среду скашивают так, чтобы в пробирке остался столбик высотой не менее 3 см.
3.23. Приготовление агара с бриллиантовым, зеленым и феноловым красным ( БФА)
3.23.1. Для приготовления растворов красок:
0.5 г бриллиантового зеленого растворяют в 100 см1 дистиллированной воды;
0,4 фенолового красного. 16 см3 0.1 моль/дм' гидроокиси натрия в IК4 см' дистиллированной
воды.
Оба приготовленных раствора в плотно закрытых флаконах выдерживают в термостате при температуре 37 "С в течение суток. Небольшим нерастворшшшмся осадком можно пренебречь.
3.23.2. Для приготовления смеси красок в 200 см' раствор фенолового красного добаатяют 5 см3 бриллиантового зеленого. Смесь хранят в холодильнике. Срок хранения смеси не ограничен.
3.23.3. В I дм3 дистиллированной воды вносят 50 г сухого питательного агара, 10 г лактозы, 40 см1 0.1 моль/дм3 соляной кислоты.
Смесь выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. затем в кипящей водяной бане не менее I ч. после чего на открытом огне (электроплитке) в течение 3 5 мин. фильтруют через lia ту (небольшой мутностью можно пренебречь).
Смесь разливают во флаконы, стерилизуют при давлении 5 • 10' Па в течение 30 мин и хранят в холодильнике до месяца со дня приготоачення.
3.23.4. В 100 см' среды с агаровой основой (п. 3.23.3), предварительно расплавленной и охлажденной до 45 'С, вносят 4,1 см3 смеси красок (п. 3.23.2). Среду разливают по чашкам Петри. Среда имеет цвет бутылочного стекла зеленовато-желтый.
3.24. Приготовление м о л о ч н о-с о л е в о г о агара
3.24.1. Дтя приготовления солевого мясо-пептонного агара 65 г/дм3 в 1 дм' расплавленного мясо-пептонного агара (пл. 3.4; 3.5) добавляют 65 г х. ч. хлористого натрия. Устанавливают рН -7.4. Стерилизуют ri автоклаве в течение 20 мин при давлении I0S Па.
3.24.2. В 100 см' расплавленного и охлажденного солевого агара ло 45 "С (п. 3.24.1) добавляют 10 см* стерильного обезжиренного молока, рахтивают по чашкам Петри. Среду хранят в холодильнике при температуре 4—9 "С в течение недели со дня приготовления.
3.25. Приготовление ж е л т о ч н о-с о л е в о г о агара (среды Чисто-в и ч)
3.25.1. Для приготовления желточного раствора в 200 см* стерильного физиологического раствора добавляют стерильно один яичный желток и раствор взбалтывают. Раствор хранят в холодильнике при температуре 4—9 *С в течение одной недели со дня приготовления.
3.25.2. В 150 см' расплавленного и охлажденного до 45 *С солевого агара 65 г/дм' (п. 3.24.1) стерильно добавляют 50 см' желточного раствора, взбалтывают и рахтивают по чашкам Петри. Среду хранят в холодильнике при температуре 4—9 С в течение недели со дня приготовления.
3.26. Приготовление нитратной плазмы
К 8 см' свежей крови кролика добавляют стерильно 2 см' лимоннокислого натрия 50 г/дм и отстаивают в холодильнике при температуре 4 9 *С в течение суток.
Допускается использовать готовую сухую нитратную плазму.
3.25.2; 3.26. (Измененная редакция. Изм. № 2).
3.27. Приготовление бульона В а й н б е р г а
3.27.1. Приготовление мясной воды из сердца крупного рогатого скота
В I дм'водопроводной воды добавляют 1 кг сердца крупного рогатого скота, пропущенного через мясорубку. Медленно нагревают до кипения, кипятят 20 мин, охлаждают, снимают жир, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
3.27.2. Приготовление пенсин-пептониой воды
В 4 дм' водопроводной воды добавляют 400 г измельченной свежей печени крупного рогатого скота. 400 г измельченных свиных желудков. 40 г соляной кислоты (плотностью 1,19 г/см ), перемешивают, подогревают до 50 "С и оставляют при комнатной температуре на 18 24 ч. Затем кипятят в течение 10 мин, декантируют (осаждают), фильтруют, добавляют 8 г двузамещенного фосфорнокислого натрия, устанавливают pH 7.4.
3.27.3. Смешивают I дм' мясной воды из сердца крупного рогатого скота (п. 3.27.1) и 2 дм' пепсин-пептон ной воды (п. 3.27.2), устанавливают pH 7,8—8.2, разливают по колбам и стерилизуют 30 мин при давлении 10* Па.
3.28. Приготовление сухой среды КПД (кит о-п ептоин о-дрожжевой)
В 1 дм1 теплой дистиллированной воды добавляют 65 г сухого порошка КПД. Устанавливают pH 7.8—8,0 и разливают в стерильную посуду с ватой. Стерилизуют 30 мин при давлении 5 • 104 Па.
3.29. Приготовление ц и к л о с е р и н о в о Й среды (С Ц С)
В I дм1 питательной основы (бульон Хотппнера п. 3.7, бульон Вайнберга п. 3.27, сухая кито-пептонно-дрожжевая п. 3.28) добавляют последовательно 5 см1 раствора 100 г/дм'сернокислого железа, 10 см1 раствори 100 г/дм1 сульфита натрия (кристаллического) и 40 см раствора 10 г/дм1 Д-циклосернна. Все перечисленные компоненты готовят отдельно на стерильной дистиллированной воде. Не следует их смешивать вместе перед добавлением к основе, гак как может образоваться осадок.
Среду хранят в холодильнике при температуре 4—9 "С не более недели со дня приготовления.
3.30. Приготовление среды В и л ь с о н-Б л е р а
Раствор хлористого железа готовят на стерильной дистиллированной воде; раствор сернистокис-лого натрия стерилизуют в течение 1 ч текучим паром.
К 100 см' расплавленного и охлажденного до температуры 80 "С мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.4 или 3.5, добавляют I г глюкозы (pH не ниже 7,2), 10 см' раствора 200 г/дм* серннстокислого натрия и 1 см' раствора 80 г/дм' хлористого железа. Смесь рахшвают в стерильные пробирки столбиком высотой по 10 см3.
3.29; 3.30. (Измененная редакция, Изм. 2).
3.31. Приготовление мясной воды
1 кг мясного фарша, приготовленного из говядины высшего сорта, заливают 2 дм' водопроводной воды и настаивают в холодильнике 24 ч; затем кипятят в течение 30 мин при постоянном помешивании и фильтруют через ватно-марлевый фильтр. К полученному фильтрату добавляют воду-до первоначального уровня.
Режим стерилизации 20 мин при давлении 10' Па.
3.32. Приготовление м я с о-п ептонного бульона (МПБ) и з мясной воды
В I дм' мясной воды добавляют 10 г пептона из 5 г хлористого натрия. Затем устанавливают рН 7.3—7.4. кипятят в течение 20 мин и фильтруют. Раствор стерилизуют 20 мин при давлении 10' 11а.
3.33. Подготовка проб
В зависимости от вида продукта объединенную пробу массой 50 г составляют из точечных проб следующим образом:
колбасные изделия в оболочке и продукты из свинины, баранины и говядины помешают в металлический или эмалированный тазик (тарелку ), тщательно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом, и дважды обжигают над пламенем (спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962).
Затем батоны разрезают продольно стерильным (фламбированиым) ножом или скальпелем на две половинки, не рассекая оболочку противоположной стороны батона. Пробу отбирают из нескольких участков центральной части и из-под оболочки обеих половинок батона;
из свиных, бараньих, говяжьих продуктов на костях и из бекона пробы вырезают стерильным инструментом из различных участков обожженного образца на глубине 2—3 см от поверхности, предпочтительно ближе к кости;
изделия без оболочки (мясные хлебы, паштеты, студни и другие изделия) исследуют с поверхности и в глубине продукта.
Для анализа поверхности изделий без оболочки, после развертывания упаковки, с поверхности исследуемых образцов делают смыв (с каждого образца новым стерильным увлажненным ватным тампоном) с тех участков, с которыми могли соприкасаться руки упаковщика.
Тампоны помешают в пробирки, заполненные на*/, их высоты средой «ХБ». Хейфена или 5 см1 среды Кесслер.
Дтя анализа глубинных участков проду кта образцы помешают в металлический или эмалированный тазик (тарелку), смачивают спиртом и обжигают. Затем делают продольный разрез и отбирают навеску методом, указанным для колбасных изделий и продуктов в оболочке, составляя из них одну объединенную пробу для каждого образца в отдельности, которую помешают в предварительно взвешенную стерильную бюксу или чашку 11етри.
3.34. Из объединенной пробы каждого образца берут в стерильную посуду (пергамент) навеску массой 20 г с погрешностью, не превышающей 0,1 г.
Навеску помешают в стерильную колбу (стакан) гомогенизатора для приготовления испытуемой взвеси. Для этого в колбу добавляют раствор 1 г/дм1 пептонной волы или стерильного физиологического раствора в четырехкратном количестве и гомогенизируют в электрическом смесителе; вначале измельчают материал на кусочки замедленной скоростью вращения ножей, затем при 15000— 20000 об/мин в течение 2,5 мин.
Допускается при отсутствии гомогенизатора приготовление испытуемой взвеси в ступке путем растирания 20 г продукта в стерильной фарфоровой ступке с 2—3 г стерильного песка, постепенно приливая 80 см' раствора I г/дм3 пептонной волы или стерильного физиологического раствора. При растирании проб вареных изделий мажущейся консистенции (ливерные, кровяные колбасы) стерильный песок можно не добавлять.
Для посевов на питательные среды стерильной градуированной пипеткой отбирают взвесь после 15 мин выдержки при комнатной температуре.
1 см' приготовленной испытуемой взвеси содержит 0,2 г продукта.
(Измененная редакция, Изм. № I. 2).
4. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА
4.1. Определение общего количества микробов в I г продукта
Метод не распрос траняется на сырокопченые колбасы.
4.1.1. Сущность метода заключается в способности мезофильных аэробов и факультативных анаэробов расти на питательном агаре при температуре (30 ± 0.5) *С с образованием колоний, видимых при увеличении 5х.
4.1.2. Проведение анализа
Питательный агар, приготовленный по пп. 3.4: 3.5, расплавляют на водяной бане и охлаждают до температуры 45 "С.
Стерильные чашки Петри раскладывают на столе, подписывают наименование анализируемого продукта, дату посева и количество посеянного продукта.
Из каждой пробы должно быть сделано не менее двух посевов, различных по объему, взятых с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. При этом на одну чашку Петри проводят посев 0.1 г, а на другую 0.01 г продукта.
Ятя посева 0.1 г продукта готовят первое десятикратное разведение испытуемой взвеси: стерильной пипеткой с широким конном отбирают 5 см1 испытуемой взвеси (приготовленной по п. 3.33), переносят ее в пробирку с 5 см' стерильного физиологического раствора или пептонной воды. Коней пипетки должен быть опушен ниже поверхности раствора, не прикасаясь к стенкам пробирки, чтобы избежать смывания бактерий с наружной стороны. 1 см' полученного раствора содержит 0.1 г испытуемого продукта.
Другой стерильной инпегкой тщательно перемешивают содержимое пробирки продуванием, отбирают 1 см( и переносят в стерильную чашку Петри, слегка приоткрывая крышку.
Ятя посева 0.01 г продукта готовят следующее разведение: другой стерильной пипеткой тщательно перемешивают содержимое пробирки, отбирают 1 см' и переносят в пробирку с 9 см* стерильного физиологического раствора. 1 см' испытуемого раствора вторичного разведения содержит 0,01 г испытуемого продукта. 1 см' этого раствора переносят в стерильную чашку Петри, как описано выше. При необходимости таким же образом готовят последующие разведения.
После внесения разведения анализируемой взвеси в чашки Пегри чашку заливают 12 15 см* расплавленного и охлажденного питательного агара при фламбнровании краев пробирки или бутылки, где он содержится. Быстро смешивают с мясо-пептоиным питательным агаром, осторожно наклоняя или вращая чашку по поверхности стола. Необходимо избегать образования пузырьков воздуха, неза-литых участков дна чашки Петри, попадания среды на края и крышку чашки.
Я™ того, чтобы помешать развитию на поверхности агара спорообразуюших микробов и бактерий 1руппы протея в Н-форме, допускается наслоение расплавленного и охлажденного до температуры 45—50 *С голодного агара толщиной 3 -4 мм.
Посте застывания агара чашки Петри перевертывают и помешают в термостат с температурой 30 'С на 72 ч. Через 72 ч подсчитывают общее количество колоний бактерий, выросших на чашках.
Колонии, выросшие как на поверхности, так и в глубине агара, подсчитывают при помощи лупы с пятикратным увеличением или специальным прибором с лупой. Ятя этого чашку кладут вверх дном на черный фон и каждую колонию отмечают со стороны дна тушью или чернилами для стекла.
4.1.1. 4.2.1. (Измененная редакция. Изм. № 2).
4.1.3. Обработка результатов
Ячя определения общего количества микробов в I г продукта подсчитанное количество колоний умножают на степень разведения анализируемого продукта.
За окончательный результат определения количества бактерий в I г анализируемого продукта принимают среднеарифметическое значений результатов подсчета двух чашек разной массы продукта.
4.2. Определение бактерий группы кишечной палочки в I г продукта
4.2.1. Сущность метода заключается на способности бактерий фуппы кишечной папочки расщеплять глюкозу и лактозу. При этом в средах «ХБ», Хейфена и КОДА образуются кислые продукты, меняющие цвет индикаторов, а вереде Кесслер в поплавке образуется газ вследствие расщепления лактозы.
Цель определения этой группы бактерий проверка соблюдения режима варки колбас или санитарно-гигиенических условий в процессе производства сырокопченых колбасных изделий.
При микробиологическом контроле колбасных изделий в производственных лабораториях можно ограничиваться обнаружением бактерий из группы кишечной палочки без их биохимической дифференциации.
4.2.2. Проведение анализа
И пробирки, содержащие по 5 см1 среды «ХБ». среды Хейфеиа двойной концентрации или среды КОЯ\. вносят по 5 см1 испытуемой взвеси (пп. 3.33; 3.34) стерильной пипеткой вместимостью 5—10 см5 с широким концом.
Допускается применение среды Кесслер по 10 см3.
Пробирки со средой «ХБ» или Кесслер. или Хейфеца, или КОДА помешают и термостат с температурой (37 ± 0.5) "С на 18—20 ч.
Посевы смывов, отобранных тампонами с поверхности изделий без оболочки, выдерживают при температуре 43 "С (для обнаружения повторного бактериального загрязнения).
При росте бактерий группы кишечной палочки среды «ХБ» и КОДА окрашиваются в желтый цвет, среда Хейфеца приобретает также желтый цвет, который может меняться до салатно-зеленого, на среде Кесслер в поплавке образуется газ.
Дчя окончательного заключения о присутствии в продукте бактерий группы кишечной палочки проводят высев со среды Кесслер (забродившие пробирки) или Хейфеца ( изменение цвета среды) в чашки Петри со средой Эндо или Плоскирева. или Левина. Чашки Петри помешают в термостат с температурой 37 'С. Через 18 20 ч посевы просматривают. На среде Эндо бактерии группы кишечной палочки образуют темно-красные колонии с металлическим блеском или ро-зово-красные без блеска, на среде Плоскирева кирпично-красные с глянцевой поверхностью, на среде Левина темно-фиолетовые колонии или фиолетово-черные блестящие. Из подозреваемых колоний готовят мазки, которые окрашивают по Граму.
Специфическое изменение среды «ХБ» и КОДА не требует дальнейшего подтверждения.
При заведомо высокой обсеменности анализируемый продукт массой не более 0,25 г помешают в пустую пробирку, в которую закладывают комочек стерильной фильтровальной бумаги размером 5x5 см. и стерильной стеклянной палочкой или фламбированной проволокой проталкивают материал до дна (не уплотняя), в пробирку наливают среду «ХБ», КОДА или Хейфеца (нормальной концентрации), заполняя ее на 3Д высоты пробирки. Пробирки помешают в термостат с температурой 37 "С на 8—10 ч. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде «ХБ-> и КОДА среда изменяет свой цвет из фиолетово-пурпурного в желтый. При росте бактерий группы кишечной палочки на среде Хейфеца среда изменяет свой цвет из красно-фиолетового в желтый, который затем может меняться до салатно-зеленого.
Пробы, отобранные с поверхности изделий без оболочки тампонами, анализируют аналогично.
4.2.3. Обработка результатов
Обнаружение грамотрицательных не образующих спор палочек, специфически изменяющих цвет жидких дифференциально-диагностических сред и образующих характерные колонии на элективных средах с лактозой, указывает на наличие бактерий группы кишечной палочки.
4.2.1 4.2.3. (Измененная редакция. Изм. № 2).
4.3. Определение бактерий из рода сальмонелл в 25 г продукта
4.3.1. Сущность метода заключается в определении характерного роста сальмонелл на элективных средах и установлении биохимических и серологических свойств.
4.3.2. Проведение анализа
Навеску продукта массой 25 г от объединенной пробы вносят во флакон Сокслета, содержащий 100 см1 среды обогащения (Мюллера, Кауфмана, хлористомагниевой среды М). Жидкость во флаконе должна подняться до метки 125 см3. Флаконы тщательно встряхивают и помешают в термостат с температурой 37 'С. Через 16 24 ч после тщательного перемешивания с помощью бактериологической петли (диаметр 0.4 0,5 мм) или пастеровской пипетки проводят посев из среды обогащения в чашки Петри с предварительно подсушенной средой Эндо, БФА, Плоскирева. Левина или висмут-сульфит-агар (110 выбору).
Чашки с посевами помещают в термостат с температурой 37 "С; посевы просматривают через 16—48 ч. на висмут-сульфит-агаре — через 24 48 ч.
На среде Эндо бактерии из рода сельмонелл образуют бесцветные или с розовым оттенком колонии.
На среде БФА сальмонеллы образуют крупные, гладкие, красноватого оттенка прозрачные колонии (колонии сальмонеллы тнфи сунс, как и на среде Эндо мелкие). Бактерии группы кишечной палочки образуют колонии желто-зеленоватого цвета. Бактерии группы протея дают рост через 72 ч.
На среде Плоскирева сальмонеллы растут в виде бесцветных колоний, но колонии более плотные и несколько меньшего размера, чем на среде Эндо.
На среде Левина сальмонеллы растут в виде прозрачных, бледных, нежно-розовых или розовато-фиолетовых колоний.
На висмут-сульфитном агаре сальмонеллы растут в виде черных или коричневых колоний с характерным металлическим блеском. При этом наблюдается прокрашивание в черный цвет участка среды под колонией. Исключение составляют некоторые серологические типы из группы С, которые на этой среде растут в виде нежных светло-зеленых или крупных серовато-зеленых колоний.
Изолированные колонии, характерные для бактерий из рода сальмонелл, пересевают на грехсахарный агар Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука штрихом по скошенной поверхности и уколом в столбик. Посевы помешают на 12 16 ч в термостат с температурой 37 С.
При росте бактерий из рода сальмонелл цвет скошенной поверхности среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука розовый, столбик желто-бурый; газообразование устанавливают по наличию трешин и разрыву столбика агара, сероводоролообразуюшие вызывают потемнение столбика.
Другие грамнегативные бактерии дают следующие изменения цвета среды:
бактерии группы кишечной палочки вся среда окрашивается в синий или сине-зеленый цвет с образованием газа или без него;
бактерии из группы протея — среда окрашивается в ярко-красный цвет, может образоваться черный осадок:
шигеллы и возбудители брюшного тифа — косяк окрашивается в розовый цвет, столбик и синий или сине-зеленый.
Допускается вместо среды Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука посев на углеводные среды в короткий пестрый ряд. включая среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, маннитом и мальтозой, полужидкий агар уколом (для определения подвижности) и бульон Хот-тннгера для определения образования индола и сероводорода.
Для дальнейшей идентификации бактерий готовят мазки, которые окрашивают но Граму, микро-скопируют и изучают серологические свойства микроорганизмов путем постановки пробной агглютинации на предметном стекле с агглютинирующей адсорбированной поливалентной саль-монеллезной О-сывороткой. При получении положительной реакции на стекле с поливалентной сывороткой проводят идентификацию с помошыо монорецепторных агглютинирующих О-сыгюроток.
Установив серологическую группу, к которой относятся исследуемые бактерии, с помощью Н-сывороток определяют тип бактерий.
(Измененная релакиия. Изм. № 1. 2).
4.3.3. Обработка резулынапш
Обнаружение подвижных (кроме S.pullorum и S.gallinarum) грамотрицательных палочек, даюшнх характерный рост на элективных средах, неферментируюших лактозу и сахарозу, ферментирующих глюкозу и маннит с образованием кислоты и газа (S.typhi suis, не ферментирует маннит). даюшнх положительную реакцию агглютинации с моиорецепторными О- и Н-сальмо-неллезными сыворотками, указывает на наличие бактерий из рода сальмонелл.
4.4. Определение протея
4.4.1. Сущность метода заключается в определении морфологии и роста на питательных средах, способности гидролнзовагь мочевину и образовывать сероводород.
4.4.2. Проведение анализа
Ятя подтверждения наличия протея в Н-форме 0.5 см' анализируемой взвеси (прнготоатенной по п. 3.34) вносят в конденсационную воду свсжескошенного мясо-пептонного агара, рахчитого в широкие пробирки, не касаясь поверхности среды (метод Шукевича). Вертикально поставленные пробирки помешают в термостат с температурой 37 "С. Через 18—24 ч посевы просматривают. Обращают внимание на образование ползучего вуалеобразиого налета с голубым оттенком; на скошенном мясо-пептониом агаре культура поднимается из конденсационной жидкости вверх по поверхности среды. При появлении характерного роста микробов рода протея, микроскопируют окрашенные по Граму мазки и изучают подвижность микробов в раздавленной или висячей капле.
Ятя обнаружения нерояшнхся «О-форм» можно проводить посев на поверхность агара Плос-кирева. -О-форма» протея растет на этой среде в виде прозрачных колоний, слегка подщелачивающих среду, окрашивая ее в желтый цвет. Делают пересев материала из подозрительных колоний в среду Крумвиде-Олькеницкого в модификации Ковальчука, где при наличиии бактерий из группы протея среда окрашивается в ярко-красный цвег (вследствие расщепления мочевины) и может образовываться черный осадок с возможным разрывом агарового столбика (вследствие образования сероводорода). 4.4.3. Обработка результатов
Обнаружение полиморфных грамотринательных палочек, образующих характерный рост на средах и Н-форме (подвижные) и О-форме (неподвижные), ферментирующих глюкозу и мочевину, неферментируюшнх лактозу и маннит, указывает на наличие бактерий из рода протея.
4.5. Определение коагулазополож и тельных стафилококков
4.5.1. Сущность метода заключается в определении морфологии, характера роста на питательных средах и в способности отдельных стафилококков продуцировать лецитиназу и коагулировать нитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
4.5.2. Проведение анатза
Из разведения анализируемой взвеси продукта (1:10) проводят посевы на молочно-солевой агар, содержащий 65 г/дм3 хлористого натрия, для выявления пигмента или ж ел точно-солевой агар, содержащий 65 г/дм3 хлористого натрия, для выявления лецитиназной активности.
В »весь наносят на поверхность агара в количестве 0,2 см ' и равномерно растирают по всей поверхности агаровой среды.
Посевы термостатируют в течение 24 ч при температуре 37 "С и 24 ч выдерживают при комнатной температуре.
На поверхности питательной среды колонии стафилококка имеют вид плоских или слегка выпуклых блестящих колоний с ровным краем. При этом на молочно-солевом агаре лучше выявляется пигмент (эмалево-белый или золотистый), а на желточно-солевом агаре колонии стафилококков могут образовывать «радужный венчик», что является одним из признаков их патогенностн.
Из подозрительных колоний готовят препараты, которые окрашивают по Граму. При наличии стафилококков в препарате обнаруживаются грамположительные мелкие кокки, располагающиеся неправильными гроздьями.
Для подтверждения признаков патогенности стафилококков ставят реакцию плазмокоагуляиии. В приборе 0,5 см' нитратной плазмы крови кролика, разведенной физиологическим раствором в соотношении 1:4. вносят петлю чистой суточной культуры стафилококка и ставят в термостат при темперазу-ре 37 "С. Реакцию плазмокоагуляиии учитывают через 3—4 ч (не встряхивая пробирку ) и оставляют в термостате на сутки для окончательного учета через 24 ч.
Дзя постановки реакции плазмокоагуляиии можно использовать также сухую нитратную плазму крови кролика.
Реакцию считают положительной, если плазма коагулируется в сгусток.
(Измененная редакция. Изм. № 1, 2).
4.5.3. Обработка результатов
Дчя определения количества стафилококков учитывают колонии стафилококков, давшие положительную реакцию плазмокоагуляиии.
При расчете на 1 г продукта количество подсчитанных колоний умножают на степень разведения и делят на количество посевного материала.
(Измененная редакция. Изм. № 1).
4.6. Определение с у л ь ф и т в о с с т а н а в л и в а ю ш и х к л о с т р и д и й
4.6.1. Сущность метода заключается в специфическом росте сульфитвосстанавливаюших клострн-дий вередах СЦС или Вильсон-Блера, на которых в результате восстановления сернистокислого натрия в сернокислый натрий происходит взаимодействие с хлористым железом и образуется почернение среды за счет сернистого железа.
4.6.2. Проведение инаипа ни сулъфипщиклосериновой среде (СЦС)
1 см' анализируемой взвеси (1:10 по п. 4.1.2) стерильной пипеткой вносят в пробирку с 9 см-жидкий сульфит-циклосериновой среды, затем проводят последовательные пересевы на аналогичные объемы среды, в результате чего получают возрастающие десятикратные разведения суспензии. Инкубацию проводят при 46 "С в течение N 12 ч. При наличии роста сульфитвосстанавливаюших клостридий образуется почернение среды.
4.6.1, 4.6.2. (Измененная редакция. Изм. № 1. 2).
4.6.2а. Проведение анализа на среде Вильсон-Блера
В пробирки, содержащие по 9 см' расплавленной и охлажденной до температуры 45 С среды Вильсон-Блера. вносят стерильной пипеткой по I см' десятикратных разведений (от 10 ' до 10 ') взвеси испытуемого продукта. Посевной материал и среду тщательно перемешивают. Посевы поме- тают в термостат с температу рой 46 'С на 8 12 ч или 37 'С на 20 ч. Появление в среде черных колоний или почернение всей среды указывает на присутствие сульфит-восстанавливаюших кло-стрндий.
Почернение среды Вильсон-Блера могут вызвать многие энтеробактерни. Для подтверждения роста сульфитвосстанавливаюших клосгрндий используют пересев в пробирки со средой Китта-Тароцци, предварительно прогретой в течение 25 мин в кипящей водяной бане и быстро охлажденной до 45 "С. Термостатирование посевов проводят при (37 ± 0,5) 'С. ежедневно в течение 5 сут проверяя н них помутнение среды, выделение газа, появление постороннего запаха, иногда разложение кусочков печени. Сразу после появлении признаков роста готовят микроскопический препарат. Материал для этого берут пастеровской пипеткой со дна пробирки. При микроскопнровании отмечают грамгю-ложительные палочки, образующие овальные споры.
У спорообразуюших I рам положи тельных микроорганизмов выявляют каталазную активность с помощью раствора перекиси водорода 30 г/дм1. Отсутствие пузырьков газа при добавлении к капле культуральной жидкости такого же количества перекиси водорода позволяет считать, что в посевах присутствуют микроорганизмы из рода клострндий.
В случае отсутствия спор в микроскопическом препарате положительной пробы на каталазу. присутствия в посевах смешанной микрофлоры, 1 —2 капли накопительной среды переносят в стерильную чашку Петри, заливают расплавленной и охлажденной до 45 'С средой Вильсон-Блера. Застывшую поверхность плотной среды заливают холодным агаром. Посевы термостатируют 24—48 ч при (37 ± 0.5) *С. Появление в нижнем слое агара черных или коричневых колоний свидетельствует о присутствии в посевах сульфитвосстанавливаюших клострндий.
(Измененная редакция. Изм. № 2).
4.6.3. Об/мботка [>езулшатов
За положительный титр клострндий (сульфит-восстановителей) принимают то максимальное разведение суспензий, в посеве которого произошло почернение среды. Например, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10 ', то считают, что в исследуемом продукте будет 10 (или I • 10') клеток в I г, если характерные изменения наблюдаются в пробирках с разведением 10 -. то считают, что в исследуемом продукте 100 (или I * 10-') микробных клеток в I г.
Комментарии